王斯聞 李波 王斯陽 李玉 李軍

CD147又被稱為細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)物（extracellular matrix metalloproteinase inducer, EMMPRIN），是免疫球蛋白超家族成員之一。CD147的表達(dá)及其與CD147功能相關(guān)的蛋白質(zhì)之間的作用在很多疾病中起著重要的作用，可刺激成纖維細(xì)胞大量分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalbproteinases, MMPs）刺激因子，參與降解細(xì)胞外基質(zhì)，并與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[1-3]。MMP-2是MMPs超家族成員之一，它能特異性降解基質(zhì)膜中的主要成分IV型膠原，使基底膜喪失完整性，還能通過毛細(xì)血管內(nèi)生、新生血管生成等促進(jìn)腫瘤生長和擴(kuò)散[4,5]。本研究采用免疫組化方法檢測(cè)CD147與MMP-2在55例肺腺癌、鱗癌組織中的表達(dá)情況，并分析其與臨床病理因素之間的相關(guān)性，探討其表達(dá)狀態(tài)與預(yù)測(cè)肺腺癌、鱗癌生物學(xué)行為的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例資料與標(biāo)本來源 2005年3月-2005年12月在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科行手術(shù)治療并經(jīng)病理確診的肺腺癌、鱗癌組織標(biāo)本及其相應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本各55例。患者男34例，女21例，年齡25歲-81歲，中位年齡57.3歲。術(shù)前均未行放療、化療等輔助治療，腫瘤均為單發(fā)。55例肺癌患者均行肺癌完全性切除，包括全肺切除4例，肺葉切除51例，其中切除上中葉3例，中下肺葉11例，單肺葉切除37例。根據(jù)Naruke肺癌淋巴結(jié)分布圖[6]行系統(tǒng)性縱隔淋巴結(jié)廓清，55例共清掃淋巴結(jié)341組，平均每例清掃6.2組。病理組織學(xué)分型依據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization, WHO）1999年發(fā)布的上皮性腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)分為鱗癌31例和腺癌24例。術(shù)后病理分期根據(jù)1997年國際抗癌聯(lián)盟TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，包括I期28例、II期9例、III期18例。

1.2 主要試劑 檸檬酸型抗原修復(fù)緩沖液（MVS-0066，粉劑）購自福建邁新公司，MMP-2鼠抗人單克隆抗體（sc-13595，濃縮型）購自美國Santa Cruz公司，CD147兔抗人多克隆抗體（ZA-0455，工作液）及SP-9000通用型免疫組化試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.3 方法 標(biāo)本常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋，4 μm切片。將檸檬酸型抗原修復(fù)緩沖液按說明書稀釋成工作液（pH=6.0），將切片于修復(fù)液中高壓修復(fù)1 min，SP法進(jìn)行免疫組化染色，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。即用型CD147兔抗人多克隆抗體和MMP-2鼠抗人單克隆抗體（工作濃度1:150）4oC孵育過夜，DAB顯色。CD147陽性反應(yīng)顆粒定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞漿，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)按免疫組化半定量評(píng)分法依據(jù)染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評(píng)分[7]。每張切片陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度按無、弱和強(qiáng)分別記為1分、2分、3分；按著色陽性細(xì)胞所占百分比分別記為0分、1分、2分、3分和4分（0: ＜10%； 1: ≥10%-＜25%； 2: ≥25%-＜50%； 3: ≥50%-＜75%；4: ≥75%），然后根據(jù)兩項(xiàng)記分之積判定其結(jié)果，分?jǐn)?shù)＜2分為陰性，≥2分為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用χ2檢驗(yàn)、Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)、Kaplan-Meier法等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD147表達(dá)情況 CD147蛋白在正常肺組織中不表達(dá)（圖1A），在61.8%（34/55）的肺腺癌、鱗癌組織中呈陽性表達(dá)（圖1B，圖1C），兩者表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。肺腺癌、鱗癌中CD147蛋白表達(dá)與年齡、性別及病理組織學(xué)分型無關(guān)（P＞0.05），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)（P＜0.05）（表1）。

2.2 MMP-2表達(dá)情況 MMP-2陽性染色定位于細(xì)胞漿（圖1D）。MMP-2在63.6%（35/55）的肺腺癌、鱗癌中陽性表達(dá)，在14.5%（8/55）相應(yīng)癌旁正常組織中表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。肺腺癌、鱗癌中MMP-2蛋白表達(dá)與年齡、性別及病理組織學(xué)分型無關(guān)（P＞0.05），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)（P＜0.05）（表1）。

2.3 肺腺癌、鱗癌中CD147與MMP-2蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析 在CD147陽性表達(dá)的肺腺癌、鱗癌病例中MMP-2蛋白表達(dá)陽性率為85.3%（29/34），在CD147陰性表達(dá)的肺腺癌、鱗癌病例中MMP-2蛋白表達(dá)陽性率為28.6%（6/21）。相關(guān)性分析顯示肺腺癌、鱗癌中CD147與MMP-2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.573, P＜0.01）（表2）。

2.4 CD147與MMP-2蛋白表達(dá)與肺腺癌、鱗癌預(yù)后的關(guān)系 31例鱗癌與24例腺癌從手術(shù)日開始隨訪5年，其中4例鱗癌與2例腺癌失訪。CD147陽性表達(dá)和陰性表達(dá)5年生存率分別為38.7%和66.7%，MMP-2陽性表達(dá)和陰性表達(dá)5年生存率分別為26.7%和58.2%，生存曲線見圖2。CD147陽性表達(dá)的肺腺癌、鱗癌患者生存率低于CD147陰性表達(dá)患者（χ2=4.76, P＜0.05）；MMP-2陽性表達(dá)的肺腺癌、鱗癌患者生存率低于MMP-2陰性表達(dá)患者（χ2=4.31, P＜0.05）。

表 1 肺腺癌、鱗癌中CD147和MMP-2蛋白的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系Tab 1 Relationship between CD147, MMP-2 expression and clinicopathological factors in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the lungs

表 2 肺腺癌、鱗癌中CD147蛋白表達(dá)與MMP-2蛋白表達(dá)的相關(guān)性Tab 2 Correlation of CD147 expression with MMP-2 expression in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the lungs

3 討論

腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素參與、多步驟的復(fù)雜過程，包括原發(fā)腫瘤浸潤、基底膜降解、腫瘤細(xì)胞進(jìn)出血管和腫瘤細(xì)胞對(duì)靶組織的侵襲等環(huán)節(jié)[8]。這個(gè)過程中細(xì)胞外基質(zhì)起著關(guān)鍵性作用，它是腫瘤遷移過程中所遇到的自然屏障。MMP-2是MMPs超家族成員之一，它能特異性降解基質(zhì)膜中的主要成分IV型膠原，使基底膜喪失完整性，還能通過毛細(xì)血管內(nèi)生、新生血管生成等促進(jìn)腫瘤生長和擴(kuò)散。CD147是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種可刺激成纖維細(xì)胞大量分泌MMPs的刺激因子。MMPs降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，從而為腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。CD147屬于免疫球蛋白超家族，分子量約58 kDa，為單鏈的跨膜糖蛋白，由269個(gè)氨基酸殘基組成，其胞膜外區(qū)有2個(gè)免疫球蛋白超家族結(jié)構(gòu)域，這種結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白可變區(qū)和II類主要組織相容性抗原復(fù)合物的β鏈非常相似[9]。目前研究表明在血液系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等均存在CD147的低表達(dá)，參與機(jī)體生殖、免疫和神經(jīng)活性等重要生理過程。近年關(guān)于CD147與腫瘤關(guān)系的研究[2,10-14]相繼報(bào)道，在前列腺癌、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)有CD147表達(dá)的增加，部分腫瘤中還發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤惡性程度的增加CD147的表達(dá)也增加，且與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移相關(guān)。

圖 1 CD147在正常肺組織與原發(fā)肺鱗癌、腺癌中的表達(dá)及MMP-2在肺腺癌中的表達(dá)（SP，×400）。A：CD147在正常肺組織中無表達(dá)；B：CD147在肺鱗癌中表達(dá)于細(xì)胞膜及細(xì)胞漿；C：CD147在肺腺癌中表達(dá)于細(xì)胞膜及細(xì)胞漿；D：MMP-2在肺腺癌中表達(dá)于細(xì)胞漿。Fig 1 The expression of CD147 in normal lung tissue, squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the lungs and the expresssion of MMP in lung adenocarcinoma (SP, ×400).A: Negative expression of CD147 in normal lung tissue； B:Positive expression of CD147 in the membrane and cytoplasm of lung squamous cell cancer cells； C: Positive expression of CD147 in the membrane and cytoplasm of lung adenocarcinoma cells； D: Positive expression of MMP in the membrane of lung adenocarcinoma cells.

圖 2 CD147與MMP-2蛋白表達(dá)與肺腺癌、鱗癌預(yù)后的關(guān)系。A：CD147陽性表達(dá)和陰性表達(dá)組肺腺癌、鱗癌患者的Kaplan-Meier生存曲線（P＜0.05）；B：MMP-2陽性表達(dá)和陰性表達(dá)組肺腺癌、鱗癌患者的Kaplan-Meier生存曲線（P＜0.05）。Fig 2 The relationship between CD147, MMP-2 expression and the prognosis of squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the lungs. A: Kaplan-Meier survival curves of lung cancer patients with CD147 expression (P＜0.05)； B:Kaplan-Meier survival curves of lung cancer patients with MMP-2 expression (P＜0.05).

本研究發(fā)現(xiàn)CD147與MMP-2在肺腺癌、鱗癌中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織（P＜0.05）。CD147和MMP-2的表達(dá)均與年齡、性別及病理組織學(xué)分型無關(guān)（P＞0.05），而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)（P＜0.05），提示CD147與MMP-2是與肺腺癌、鱗癌惡性生物學(xué)行為關(guān)系密切的預(yù)測(cè)因子。III期肺腺癌、鱗癌患者CD147的陽性表達(dá)率（88.9%）明顯高于II期患者（48.6%）（P＜0.05），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者CD147陽性表達(dá)率（77.8%）明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（46.4%）（P＜0.05）。本研究的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相符，Sun等[15]認(rèn)為CD147通過刺激成纖維細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多種MMPs降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，首先促進(jìn)腫瘤的局部浸潤而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌、鱗癌中CD147與MMP-2呈現(xiàn)高頻率的同時(shí)陽性表達(dá)，相關(guān)性分析示肺腺癌、鱗癌中CD147蛋白表達(dá)與MMP-2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，提示CD147可能刺激MMPs的分泌并上調(diào)MMP-2的表達(dá)水平。Sun等[15]將人乳腺癌細(xì)胞系MDA-435 CD147沉默后，MMP-2表達(dá)下降且細(xì)胞侵襲性下降，認(rèn)為CD147通過MMP-2在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中起重要作用。Zhong等[16]研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌中CD147表達(dá)與MMP-1, 2, 9的表達(dá)呈明顯正相關(guān)，CD147和MMP-2表達(dá)與TNM及Gleason分期呈正相關(guān)，且同時(shí)表達(dá)CD147和MMP-2的患者預(yù)后差，這表明CD147與MMP-2在前列腺癌的浸潤轉(zhuǎn)移中起重要作用。Wu等[18]報(bào)道CD147與MMP-2在膽囊癌中表達(dá)明顯高于慢性膽囊炎性病變，且CD147與MMP-2同時(shí)陽性表達(dá)預(yù)后最差，可見兩者在膽囊的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，聯(lián)合檢測(cè)可以提示膽囊癌預(yù)后。因此，CD147與MMP-2同時(shí)陽性表達(dá)是多種惡性腫瘤預(yù)后差的重要標(biāo)志。Norgauer等[18]提出CD147刺激MMPs分泌的機(jī)制為CD147刺激腫瘤周圍成纖維細(xì)胞分泌MMPs，從而導(dǎo)致基底膜和間質(zhì)成分降解，同時(shí)能與MMPs形成復(fù)合物而加強(qiáng)MMPs對(duì)腫瘤間質(zhì)的降解，更利于腫瘤向周圍浸潤及轉(zhuǎn)移。

CD147在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移中的作用與通過刺激腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分泌和活化MMPs有關(guān)，其主要是間質(zhì)成纖維細(xì)胞分泌，包括介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞之間、腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用，形成腫瘤細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶類-基質(zhì)成分構(gòu)成的腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的局部微環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示CD147和MMP-2的表達(dá)與肺腺癌、鱗癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，與其侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，兩者聯(lián)合檢測(cè)可作為判斷肺腺癌、鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的客觀參考指標(biāo)。