李厚勇 周梁 王璟 叢寧

·臨床研究·

鼻腔黏膜惡性黑色素瘤活化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶表達(dá)及臨床特征分析

李厚勇 周梁 王璟 叢寧

目的觀察鼻腔黏膜惡性黑色素瘤活化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)的表達(dá)，分析ERK活化與臨床特征之間的關(guān)系。方法從20例鼻腔黏膜惡性黑色素瘤患者的腫瘤新鮮凍存組織中提取總蛋白，并采用蛋白印跡方法檢測(cè)活化ERK的表達(dá)。對(duì)20例患者進(jìn)行隨訪，觀察腫瘤復(fù)發(fā)及頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果20例鼻腔黏膜惡性黑色素瘤組織中，活化ERK表達(dá)陽(yáng)性12例，其中9例術(shù)后復(fù)發(fā)，3例發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；在8例活化ERK表達(dá)陰性患者中，2例術(shù)后復(fù)發(fā)，1例發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移?；罨疎RK表達(dá)陽(yáng)性患者的復(fù)發(fā)情況高于ERK表達(dá)陰性的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)；而兩者間頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。結(jié)論鼻腔黏膜惡性黑色素瘤活化ERK表達(dá)陽(yáng)性患者更易復(fù)發(fā)。(中國(guó)眼耳鼻喉科雜志，2011，11：30-32)

黑色素瘤； 鼻腔； 細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶； 復(fù)發(fā)； 轉(zhuǎn)移

惡性黑色素瘤是惡性程度較高的一類腫瘤，好發(fā)于皮膚，原發(fā)于鼻腔鼻竇者較少。有學(xué)者[1-2]對(duì)皮膚惡性黑色素瘤進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)RAS-RAF-ERK途徑信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中起著重要作用；但對(duì)鼻腔黏膜惡性黑色素瘤中RAS-RAF-ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及該通路與腫瘤的臨床特征間聯(lián)系的研究少有報(bào)道。本研究擬采用蛋白印跡法檢測(cè)鼻腔黏膜惡性黑色素瘤中持續(xù)活化的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)，觀察活化ERK在腫瘤組織中的表達(dá)情況，并與腫瘤的臨床特征進(jìn)行比較，以期發(fā)現(xiàn)活化ERK的表達(dá)與腫瘤臨床特征之間的聯(lián)系。

1 資料與方法

1.1 資料 2005年12月至2009年6月我科收治的鼻腔黏膜惡性黑色素瘤手術(shù)患者20例,其中男性13例、女性7例；年齡40～75歲，平均55.8歲。臨床表現(xiàn)為鼻塞18例，涕中帶血15例，鼻出血5例。鼻內(nèi)鏡檢查：鼻腔內(nèi)褐色或黑色腫物，表面不光滑。病理活組織檢查提示鼻腔黏膜惡性黑色素瘤。所有患者均行手術(shù)治療，其中13例行鼻側(cè)切開(kāi)術(shù)，5例行部分上頜骨截除術(shù)，2例行上頜骨截除術(shù)；2例同時(shí)行頸廓清術(shù)，2例術(shù)后半年出現(xiàn)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而行頸廓清術(shù)。術(shù)中取20例新鮮腫瘤組織并液氮凍存，作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。術(shù)后病理及免疫組織化學(xué)證實(shí)為惡性黑色素瘤。以眶外傷行鼻內(nèi)鏡手術(shù)患者的鼻腔黏膜作為健康對(duì)照組。按照術(shù)中所見(jiàn)的腫瘤范圍及CT診斷情況，根據(jù)國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)TMN分類標(biāo)準(zhǔn)(1997)，對(duì)20例患者進(jìn)行腫瘤分期，其中2期3例、3期13例、4期4例。所有患者術(shù)后隨訪1～3年。

1.2 方法 儀器及試劑：Allegra 25R冰凍離心機(jī) (貝克曼生物公司)，膠片分析儀(上海天能公司)，紫外分光光度計(jì)(HACH公司，美國(guó))，總蛋白抽提液(上海普飛生物公司)，兔抗人磷酸化ERK抗體 (Cell signaling technology公司)，丙烯酰胺(Sigma公司，美國(guó))，酶標(biāo)二抗 (Sigma公司，美國(guó)),硝酸纖維素膜(Whatman公司)。

切取液氮凍存標(biāo)本100 mg,迅速研磨粉碎；然后加300～500 μL 細(xì)胞裂解液( 磷酸鹽緩沖液內(nèi)加蛋白酶和磷酸化酶抑制劑)裂解細(xì)胞, 以6 500 ×g離心10 min (r=15 cm,4 ℃)；取上清液測(cè)蛋白濃度,并調(diào)整各樣本濃度一致。然后采用蛋白印跡法；經(jīng)蛋白電泳、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印、抗體偶聯(lián)物免疫檢測(cè)和放射自顯影等步驟，測(cè)定鼻腔黏膜惡性黑色素瘤組織中活化ERK1/2蛋白的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用精確χ2檢驗(yàn)對(duì)本組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

20例鼻腔黏膜惡性黑色素瘤中，有12例活化ERK表達(dá)陽(yáng)性；鼻腔黏膜正常組織中無(wú)活化ERK表達(dá)(附4頁(yè)圖①)。12例活化ERK表達(dá)陽(yáng)性患者中，伴頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移3例，術(shù)后復(fù)發(fā)9例；8例活化ERK表達(dá)陰性患者中，伴頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移1例，術(shù)后復(fù)發(fā)2例。經(jīng)精確χ2檢驗(yàn)，兩組間頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.363 26)；活化ERK表達(dá)組的術(shù)后復(fù)發(fā)病例數(shù)高于無(wú)活化ERK表達(dá)組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.036 68)。

12例活化ERK表達(dá)患者中，腫瘤分期2期2例，3期8例，4期2例；8例無(wú)活化ERK表達(dá)患者中，腫瘤分期2期1例，3期4例，4期2例。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，結(jié)果顯示ERK表達(dá)與腫瘤分期間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.135，Pgt;0.05)。

3 討論

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)是一系列絲氨酸/蘇氨酸激酶，可磷酸化其他細(xì)胞質(zhì)蛋白，并從胞質(zhì)移位至細(xì)胞核而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性。在人類細(xì)胞內(nèi)，高度保守的MAPKs是信號(hào)從細(xì)胞表面轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者，主要參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡的過(guò)程。在MAPKs家族中[3-5]，ERK是最先發(fā)現(xiàn)并被了解最多的成員。ERK包括兩種異構(gòu)體：ERK1和ERK2(分別為p44和p42)。許多絲裂原可激活ERK級(jí)聯(lián)反應(yīng)，如上皮生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子、血栓素A2、血管緊張素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子和胰島素等。生長(zhǎng)因子與細(xì)胞表面的受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)結(jié)合，誘發(fā)生長(zhǎng)因子受體胞質(zhì)中的酪氨酸殘基自主磷酸化，導(dǎo)致受體二聚體化與活化。磷酸化的酪氨酸殘基可以與生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2(Grb2)結(jié)合，并通過(guò)該蛋白的SH2結(jié)構(gòu)域與鳥嘌呤核苷酸交換因子(Sos)形成復(fù)合物。細(xì)胞表面的生長(zhǎng)因子受體具有募集Grb2與Sos復(fù)合物的能力。Sos與生長(zhǎng)因子受體結(jié)合的過(guò)程中，移位至胞質(zhì)并與RAS相互作用，促進(jìn)RAS與GTP結(jié)合，從而使RAS被激活而成為具有功能活性的RAS蛋白。GTP偶聯(lián)的RAS蛋白能與RAF結(jié)合，并以一種目前未知的作用方式激活RAF蛋白?；罨腞AF蛋白即MAPK激酶激酶(MAPKKK)可以磷酸化并激活MAPK激酶(MEK)，活化的MEK可以進(jìn)一步磷酸化并活化ERK1/2[4-5]。

目前研究發(fā)現(xiàn)，RAS-RAF-MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在皮膚惡性黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[6-11]。癌基因RAF可以調(diào)控Raf 蛋白的合成，Raf蛋白是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。活化的RAF蛋白可以激活MAPK信號(hào)通路，導(dǎo)致ERK1/2的持續(xù)活化[3，5,12]。ERK是MAPK/ERK路徑的效應(yīng)子[13],活化的ERK可以磷酸化ELK-1 ( Ets like transcription factor-1)、c-FOS、c-JUN、NF-κb(nuclear factor of kappa b)等蛋白[5，13],在細(xì)胞多種正常生理過(guò)程中(如細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂、死亡等)發(fā)揮作用。ERK過(guò)度活化后,還可通過(guò)影響cyclin、MITF (microphthalmia- associated transcription factor)、MMP (matrix metalloprotease)等因子促使細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)度和分化不良,致細(xì)胞間黏附力下降，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[4-5，13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在鼻腔黏膜惡性黑色素瘤中，ERK1/2的活化率達(dá)60%，而正常鼻腔黏膜組織中無(wú)活化的ERK，說(shuō)明ERK信號(hào)通路的持續(xù)活化與鼻腔黏膜惡性黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展有較為密切的關(guān)系。結(jié)合本文隨訪結(jié)果，在12例活化ERK表達(dá)的鼻腔黏膜惡性黑色素瘤患者中，術(shù)后復(fù)發(fā)9例，伴頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者3例；而在8例無(wú)活化ERK表達(dá)的患者中，術(shù)后復(fù)發(fā)2例，伴頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者1例。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，兩組間在術(shù)后復(fù)發(fā)率上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示活化ERK與鼻腔黏膜惡性黑色素瘤的復(fù)發(fā)關(guān)系密切。12例活化ERK表達(dá)患者中，腫瘤分期2期2例，3期8例，4期2例；8例無(wú)活化ERK表達(dá)患者中，腫瘤分期2期1例，3期4例，4期2例。采用χ2檢驗(yàn)，兩組間在腫瘤分期間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本文研究提示，可以通過(guò)檢測(cè)ERK的活性，推測(cè)鼻腔黏膜惡性黑色素瘤的復(fù)發(fā)可能，并對(duì)惡性黑色素瘤復(fù)發(fā)的早期發(fā)現(xiàn)和干預(yù)提供新的研究方向和思路。

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2010-10-11)

(本文編輯 楊美琴)

·消息·

第48屆國(guó)際臨床視覺(jué)電生理協(xié)會(huì)年會(huì)在澳大利亞召開(kāi)

第48屆國(guó)際臨床視覺(jué)電生理協(xié)會(huì)(ISCEV)年會(huì)于2010年11月6—10日在澳大利亞西部城市珀斯的Fremantle舉行，來(lái)自26個(gè)國(guó)家的300多名代表出席了本次年會(huì)。代表們就視覺(jué)電生理各個(gè)方面的內(nèi)容以大會(huì)發(fā)言、展板和病例討論等形式進(jìn)行了廣泛深入的交流探討。本次年會(huì)Emiko Adachi Award Lecture的演講嘉賓是日本名古屋愛(ài)知醫(yī)科大學(xué)的Yozo Miyake教授，他作了題為“建立完全型和非完全型先天性靜止性夜盲以及隱匿性黃斑營(yíng)養(yǎng)不良臨床新概念”的演講。澳大利亞國(guó)立大學(xué)的Trevor Lamb教授做了“視網(wǎng)膜電圖不同成分的細(xì)胞來(lái)源”的主題演講。美國(guó)密西根大學(xué)的Heckenlively教授應(yīng)邀做了“預(yù)后因素在Stargardt病臨床分析和表型間的關(guān)系”的專題報(bào)告。多焦視覺(jué)電生理發(fā)明人Erich Sutter教授的專題講座是“探索視覺(jué)電生理新的可能性”。大會(huì)發(fā)言交流的主要內(nèi)容涉及視覺(jué)電生理在神經(jīng)眼科的應(yīng)用，多焦電生理技術(shù)進(jìn)展，影響視覺(jué)系統(tǒng)的藥物毒性監(jiān)控，兒童電生理，視覺(jué)電生理擴(kuò)展程序的應(yīng)用，視網(wǎng)膜疾病的電生理、基因和影像學(xué)，動(dòng)物模型的電生理和影像學(xué)等方面。專為鼓勵(lì)青年科學(xué)家設(shè)立的Eberhard Dodt Memorial Award，今年授予來(lái)自澳大利亞墨爾本的Yu Xiang George Kong。年會(huì)還就2013年第51屆ISCEV年會(huì)的地點(diǎn)讓參與競(jìng)選的中國(guó)重慶和新加坡作了參選介紹，香港中文大學(xué)的賴旭佑教授代表中國(guó)作了精彩的申辦陳述，中華眼科學(xué)會(huì)視覺(jué)生理組組長(zhǎng)陰正勤教授代表中華眼科學(xué)會(huì)主任委員趙堪興教授向各位代表發(fā)出熱情邀請(qǐng)。新加坡的代表也作了富有吸引力的陳述。按照協(xié)會(huì)規(guī)定，最后當(dāng)選的舉辦城市由所有會(huì)員投票決定。

本次年會(huì)在主辦方的精心安排下取得圓滿成功，會(huì)議學(xué)術(shù)氣氛濃厚，與會(huì)者在充分學(xué)習(xí)交流的同時(shí)，也享受東道主的熱情好客。傳統(tǒng)的ISCEV奧林匹克競(jìng)賽為緊張的會(huì)議安排增添不少輕松，愉快的氣氛，中國(guó)代表參與的亞洲隊(duì)喜獲銅獎(jiǎng)。

王敏

Analysisofextracellularregulatedproteinkinaseactivationandclinicalcharacteristicsinpatientswithnasalmucosamelanomas

LIHou-yong,ZHOULiang,WANGJing,CONGNing.DepartmentofOtorhinolaryngology,EyeEarNoseandThroatHospital,FudanUniversity,Shanghai200031,China

Corresponding author：LI Hou-yong,Email:lihouy2000@yahoo.com.cn

ObjectiveTo determine the expression of activated extracellular regulated protein kinases (ERK) and to analyze the relationship between the ERK activation and clinical characteristics in patients with nasal mucosa melanomas.MethodsTwenty nasal mucosa melanomas samples were collected. Total protein was obtained and the activated ERK was detected by Western blot. These patients were followed-up for 1 to 3 years.ResultsThe phosphorylated ERK protein was detected in 12 samples. In 12 patients with ERK activation, the recurrence and cervical lymph node metastasis after surgery was observed in 9 cases and 3 cases respectively. In 8 patients without ERK activation, the recurrence and cervical lymph node metastasis after surgery was observed in 2 cases and 1 case respectively. There was a significant difference in recurrence (Plt;0.05), but not in cervical lymph node metastasis (Pgt;0.05) between patients with or without ERK activation.ConclusionsIn nasal mucosa malignant melanomas, the recurrence in patients with ERK activation was possibly more than that in patients without ERK activation.(Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2011,11:30-32)

Melanoma; Nasal; Extracellular regulated protein kinases; Recurrence; Metastasis

復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻喉科 上海 200031

李厚勇(Email：lihouy2000@yahoo.com.cn)