王振海 姜軍坡 王選 王世英 朱寶成

益生菌是人們?nèi)找骊P(guān)注的抗生素替代品之一，無毒、無害、無副作用，可參與蛋白質(zhì)和維生素的合成，維持腸道正常菌群的平衡，發(fā)揮生物屏障作用，增強免疫力。益生菌的開發(fā)及利用在各國均受到重視，其應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)的良好效果早已被大量的試驗和生產(chǎn)實踐所證實。隨著我國養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，益生菌制劑作為飼料添加劑具有廣闊的發(fā)展前景。

芽孢桿菌具有抗逆性強、能產(chǎn)生多種酶和維生素、生產(chǎn)工藝容易掌握等諸多優(yōu)越性，因此芽孢桿菌類益生菌在畜牧業(yè)和飼料行業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用。發(fā)酵條件優(yōu)化對工業(yè)生產(chǎn)有著重要意義，是產(chǎn)業(yè)化的必需環(huán)節(jié)。通過發(fā)酵優(yōu)化可以提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。如秦艷等通過對蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵條件優(yōu)化的研究，改變了它的生長參數(shù)，提高了生物量及芽孢產(chǎn)率；楊鶯鶯等通過對益生菌D-1液體發(fā)酵工藝的研究，提高了益生菌D-1的菌體得率和芽孢產(chǎn)率。

豬源益生菌株Bacillus velezensis Z-27是從健康仔豬的糞便中篩選出來的，對大腸桿菌有顯著拮抗活性的優(yōu)良菌株。本研究以芽孢產(chǎn)率和生物量為指標(biāo)，通過單因素試驗和正交試驗對Bacillus velezensis Z-27菌株產(chǎn)芽孢的發(fā)酵條件優(yōu)化，為工業(yè)生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

豬源益生菌株Bacillus velezensis Z-27，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院制藥工程系分離并保存。

1.2 培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基，見程麗娟等編寫的《微生物學(xué)實驗技術(shù)》。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2%、蛋白胨2%、NaH2PO4·2H2O 0.2%、Na2HPO4·2H2O 0.4%、MgSO4·7H2O 0.05%、CaCl20.02%，pH值7.0～7.2。

1.3 試驗方法

1.3.1 種子液培養(yǎng)

從-20℃甘油保藏管中用滅菌竹簽蘸取少量的豬源芽孢益生菌Z-27菌懸液，接種于新鮮的NA斜面，37℃培養(yǎng)24 h進行活化。從活化斜面挑取Z-27菌苔，接種于裝有100 ml NB培養(yǎng)基的250 ml錐形瓶中，220 r/min、37℃，搖床培養(yǎng)18 h后備用。

1.3.2 生長曲線的測定

將上述種子培養(yǎng)液接種于裝有100 ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基的250 ml錐形瓶中，接種量為2%，220 r/min、37℃搖瓶培養(yǎng)，分別在0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20 h取樣，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白，測定發(fā)酵液在600 nm條件下的吸光度值，通過吸光度的大小間接衡量生物量，以時間為橫坐標(biāo)、OD600值為縱坐標(biāo)，繪制益生菌Z-27的生長曲線。

1.3.3 生物量測定

梯度稀釋平板培養(yǎng)計數(shù)法。用10倍稀釋法將發(fā)酵液稀釋，用移液槍分別吸取10-6、10-7、10-83個梯度稀釋液100 μl于NA平板內(nèi)，用滅過菌的涂布棒涂布均勻，每個稀釋度涂布3個平板，37℃恒溫培養(yǎng)24～48 h。對菌落數(shù)為30～300個的平板進行菌落計數(shù)，用單菌落數(shù)目乘以稀釋倍數(shù)即得發(fā)酵液的生物量。

1.3.4 芽孢產(chǎn)率測定

芽孢計數(shù)法是把菌液80℃水浴10 min后稀釋平板計數(shù)，芽孢產(chǎn)率即為80℃水浴計數(shù)與發(fā)酵液的活菌計數(shù)之比。

1.3.5 不同碳源對Z-27菌株搖瓶發(fā)酵生物量和芽孢產(chǎn)率的影響

分別以2%的玉米粉、蔗糖、乳糖、淀粉、糊精、甘露醇、麩皮作為碳源替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，其它成分不變。以種子培養(yǎng)液接種，接種量為2%、裝瓶量50 ml/250 ml、220 r/min、37℃搖瓶發(fā)酵24 h后測定發(fā)酵液生物量和芽孢產(chǎn)率，比較不同碳源對發(fā)酵液生物量和芽孢產(chǎn)率的影響。

1.3.6 不同氮源對Z-27菌株搖瓶發(fā)酵生物量和芽孢產(chǎn)率的影響

分別以2%的花生粉、豆餅粉、尿素、硫酸銨、硝酸銨、胰蛋白胨、酵母浸膏作為氮源替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨，以上述試驗的最優(yōu)碳源替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，其它成分不變。以種子培養(yǎng)液接種，接種量為2%、裝瓶量50 ml/250 ml、220 r/min、37℃搖瓶發(fā)酵24 h后測定發(fā)酵液生物量和芽孢產(chǎn)率，比較測定不同氮源對發(fā)酵的影響。

1.3.7 不同無機鹽對Z-27菌株搖瓶發(fā)酵生物量和芽孢產(chǎn)率的影響

分別添加0.02%的FeSO4、ZnSO4、CuSO4、MnSO4、MgSO4·7H2O替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的無機鹽成分CaCl2，以上述試驗的最優(yōu)碳源和氮源替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖和蛋白胨，其它成分不變。以種子培養(yǎng)液接種，接種量為2%、裝瓶量50 ml/250 ml、220 r/min、37℃搖瓶發(fā)酵24 h后測定發(fā)酵液生物量和芽孢產(chǎn)率，比較不同無機鹽對發(fā)酵的影響。

1.3.8 Z-27菌株搖瓶發(fā)酵正交試驗設(shè)計

根據(jù)以上單因素試驗的結(jié)果，利用L16（45），選擇最佳碳源、最佳氮源、最佳無機鹽、pH值及接種量5個因素，進行5因素4水平正交試驗。以生物量和芽孢產(chǎn)率為衡量指標(biāo)，每個試驗作3個平行，取平均值。正交試驗設(shè)計見表1。

表1 Z-27菌株搖瓶發(fā)酵正交試驗設(shè)計

1.3.9 裝瓶量對Z-27菌株搖瓶發(fā)酵生物量和芽孢產(chǎn)率的影響

根據(jù)正交試驗結(jié)果配制發(fā)酵培養(yǎng)基。以種子培養(yǎng)液接種，根據(jù)正交試驗結(jié)果選擇最佳接種量，裝瓶量分別以30 ml/250 ml、50 ml/250 ml、70 ml/250 ml、90 ml/250 ml，37℃、220 r/min條件下培養(yǎng)24 h，通過測定發(fā)酵液生物量和芽孢產(chǎn)率，比較不同裝瓶量對發(fā)酵的影響。

1.3.10 轉(zhuǎn)速對Z-27菌株搖瓶發(fā)酵生物量和芽孢產(chǎn)率的影響

根據(jù)正交試驗結(jié)果配制發(fā)酵培養(yǎng)基。以種子培養(yǎng)液接種，根據(jù)上述試驗選擇最佳接種量及裝瓶量，37℃，分別在靜止、170 r/min、200 r/min、220 r/min條件下培養(yǎng)24 h，通過測定發(fā)酵液生物量和芽孢產(chǎn)率，比較不同搖瓶轉(zhuǎn)速對發(fā)酵的影響。

1.3.11 溫度對Z-27菌株搖瓶發(fā)酵生物量和芽孢產(chǎn)率的影響

根據(jù)正交試驗結(jié)果配制發(fā)酵培養(yǎng)基。以種子培養(yǎng)液接種，根據(jù)上述試驗結(jié)果選擇最佳接種量、裝瓶量及轉(zhuǎn)速，分別以25、30、37℃條件下培養(yǎng)24 h，通過測定發(fā)酵液的生物量和芽孢產(chǎn)率，比較不同溫度對發(fā)酵結(jié)果的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 Z-27菌株生長曲線（見圖1）

由圖1可知，培養(yǎng)時間為12 h時，發(fā)酵液處于生長對數(shù)期末期，即此時發(fā)酵液中的細菌處于生長旺盛階段且達到較高的生物量。因此，Z-27菌株的種子液培養(yǎng)時間以12 h為宜，故本文以下各試驗中種子液培養(yǎng)時間皆為12 h。

圖1 菌株生長曲線

2.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.2.1 不同碳源對搖瓶發(fā)酵的影響（見圖2）

圖2 不同碳源對Z-27菌株生物量和芽孢產(chǎn)率的影響

碳源優(yōu)化試驗結(jié)果表明，以玉米粉、葡萄糖、麩皮作為碳源的發(fā)酵液芽孢產(chǎn)率都在80%以上，但是麩皮作為碳源的發(fā)酵液生物量太低，葡萄糖價格較高，因此選用玉米粉為最佳碳源。

2.2.2 不同氮源對搖瓶發(fā)酵的影響（見圖3）

氮源優(yōu)化試驗結(jié)果表明，以花生粉、豆餅粉作為氮源發(fā)酵效果最好，生物量較大，達到4.24×109cfu/ml和4.32×109cfu/ml，芽孢產(chǎn)率也分別為90%和93%。該菌株對有機氮源的利用普遍優(yōu)于無機氮源，故以豆餅粉為最佳氮源。

2.2.3 不同無機鹽對搖瓶發(fā)酵的影響（見圖4）

由圖4可以看出，以Mn2+作為無機鹽的生物量和芽孢產(chǎn)率都比較高，生物量達到2.97×109cfu/ml，芽孢產(chǎn)率達到90%。因此，選擇MnSO4作為最佳無機鹽。

圖3 不同氮源對Z-27菌株生物量和芽孢產(chǎn)率的影響

圖4 不同無機鹽對Z-27菌株生物量和芽孢產(chǎn)率的影響

2.2.4 Z-27菌株搖瓶發(fā)酵正交試驗結(jié)果分析（見表2）

由表2可知，極差值R豆餅粉＞R接種量＞R玉米粉＞RMnSO＞RpH值，可知豆餅粉為主要影響因素，接種量影響次之。2號試驗組合發(fā)酵液生物量最高，達2.03×1010cfu/ml，芽孢產(chǎn)率為95%。由均值K得出的最佳組合為A2B2C2D2E2，但是在正交試驗表中沒有這個組合，通過驗證試驗，該組合發(fā)酵液的生物量為2.33×1010cfu/ml，芽孢產(chǎn)率為96%。因此，確定Z-27的最佳培養(yǎng)條件為玉米粉1%、豆餅粉1.5%、MnSO40.03%、起始pH值為7、接種量為2%。

表2 Z-27菌株搖瓶發(fā)酵正交試驗結(jié)果及其極差分析

2.2.5 裝瓶量對搖瓶發(fā)酵的影響（見圖5）

由圖5可以看出，當(dāng)裝瓶量為50 ml/250 ml和100 ml/250 ml時芽孢產(chǎn)率達到85%以上，但是裝瓶量為100 ml/250 ml時生物量較低，故50 ml/250 ml為最佳裝瓶量。

2.2.6 搖床轉(zhuǎn)速對搖瓶發(fā)酵的影響(見圖6）

由圖6可知，轉(zhuǎn)速為220 r/min時生物量較大，達到2.57×109cfu/ml，芽孢產(chǎn)率為94%，故220 r/min條件為最佳轉(zhuǎn)速條件。

2.2.7 溫度對搖瓶發(fā)酵的影響（見圖7）

比較發(fā)現(xiàn)，溫度為30℃和37℃時芽孢產(chǎn)率達到90%以上，由于30℃時生物量較低，因此選擇37℃為最佳發(fā)酵溫度。

3 結(jié)論與討論

本研究對豬源益生菌株Bacillus velezensis Z-27進行發(fā)酵條件優(yōu)化，確定了Z-27菌株搖瓶發(fā)酵的最佳條件為：玉米粉1%、豆餅粉1.5%、MnSO40.03%、NaH2PO4·2H2O 0.2%、Na2HPO4·2H2O 0.4%，初始pH值7.0，250 ml三角瓶裝瓶量50 ml，接種量2%，搖瓶轉(zhuǎn)速220 r/min，發(fā)酵溫度37℃。優(yōu)化前發(fā)酵液生物量為6.9×109cfu/ml，芽孢產(chǎn)率為82.5%，培養(yǎng)條件優(yōu)化后生物量可達2.33×1010cfu/ml，芽孢產(chǎn)率達96.0%，芽孢濃度提高了3.9倍。

圖5 裝瓶量對Z-27菌株生物量和芽孢產(chǎn)率的影響

圖6 搖床轉(zhuǎn)速對Z-27菌株生物量和芽孢產(chǎn)率的影響

圖7 溫度對Z-27菌株生物量和芽孢產(chǎn)率的影響

由于Z-27菌株為芽孢桿菌，菌體較小，自身帶有鞭毛，若采用血球計數(shù)法，不易進行顯微鏡下的觀察計數(shù)。而活菌計數(shù)法雖然操作復(fù)雜，但適于此類菌種的計數(shù)，劉惠知等對蠟樣芽孢桿菌計數(shù)亦采用了此方法。

發(fā)酵優(yōu)化中以生物量和芽孢產(chǎn)率為主要指標(biāo)，是因為在飼喂動物時益生素必須含有一定量活菌。一般要求每克益生素含有3億個以上的活菌體，且活力要強。芽孢桿菌以孢子形式可耐受飼料加工、儲藏及胃內(nèi)酸性環(huán)境，對不良貯存條件和飼料加工條件耐受力要強。較高的生物量和芽孢產(chǎn)率有利于產(chǎn)品的加工、儲存，可保證其質(zhì)量。優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方中，氮源（豆餅粉）含量高于碳源，可能是因為豆餅粉是一種天然培養(yǎng)基，也可作為碳源被Z-27菌株所利用。在做不同無機鹽對發(fā)酵影響的試驗時，添加Cu2+、Zn2+后發(fā)酵的生物量較低，幾乎沒有產(chǎn)生芽孢，可能是Cu2+、Zn2+本身抑制菌的生長。

本研究對Bacillus velezensis Z-27菌株產(chǎn)芽孢的搖瓶發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，達到了較高的芽孢濃度，為進一步的小試及中試奠定了基礎(chǔ)。