王劍 孫會(huì)

鈣蛋白酶(Calpain)是存在于細(xì)胞質(zhì)中的依賴于Ca2+的中性半胱氨酸內(nèi)肽酶，主要存在于肌纖維Z盤附近和肌質(zhì)網(wǎng)膜上。目前已證實(shí)哺乳動(dòng)物體內(nèi)鈣蛋白酶存在13種同工酶，包括7種無(wú)組織特異性表達(dá)的Calpain1、2、4、5、7、10和12；6種組織特異性表達(dá)的Calpain3、6、8、9、11和13[1]，其中有關(guān)Calpain1和Calpain2的研究最為深入。Calpain1和Calpain2兩種異構(gòu)體根據(jù)鈣蛋白酶表現(xiàn)半最高活性所需的Ca2+濃度的不同又稱為μ-Calpain和m-Calpain。其中μ-Calpain所需的Ca2+為1～12 μmol/l，而m-Calpain則需要250～750 μmol/l[2]。由于m-Calpain需要較高濃度Ca2+激活，而宰后肌肉中Ca2+濃度很難達(dá)到，所以在肌肉嫩化過(guò)程中μ-Calpain參加反應(yīng)并對(duì)肌肉嫩度有改善作用，是肌肉蛋白降解的重要酶類。近些年μ-Calpain基因作為肉品質(zhì)的候選基因在豬、牛、羊的研究中已經(jīng)有所報(bào)道，而關(guān)于家禽類動(dòng)物的研究報(bào)道并不多。本試驗(yàn)主要研究高鈣日糧對(duì)鵝不同部位肌肉μ-Calpain mRNA表達(dá)量的影響，從而確定在日糧中添加鈣的適宜劑量以改善鵝肉品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選用體重近似、性別一致、健康狀況良好的8周齡農(nóng)安籽鵝120只。預(yù)飼期7 d，試驗(yàn)期28 d。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用2因素4水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。設(shè)4個(gè)處理組，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧(Ca 0.6%)，試驗(yàn)1組(Ca 0.9%)，試驗(yàn)2組(Ca 1.2%)，試驗(yàn)3組(Ca 1.5%)。鈣源均采用丙酸鈣。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只鵝。

1.3 日糧配制（見(jiàn)表1）

表1 日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

采用玉米-豆粕型日糧，日糧參照美國(guó)NRC(1994版)禽的營(yíng)養(yǎng)需要進(jìn)行設(shè)計(jì)，并采用粉料形式進(jìn)行配制。

1.4 飼養(yǎng)管理

在試驗(yàn)期內(nèi)，采用地面分圈散養(yǎng)。每日飼喂三次(早8:00，中午11:30，晚4:30)，每次喂料量以吃飽后略有剩余為準(zhǔn)，記錄采食量，自由飲水。

1.5 樣本采集及各組織總RNA的提取

本試驗(yàn)分別于7、14、21、28 d進(jìn)行屠宰，取胸肌、腿肌大約100 mg置于凍存管內(nèi)在液氮罐中暫存，之后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中保存。分別取4組鵝胸肌和腿肌肉各50 mg，按RNA抽提試劑盒的使用說(shuō)明分別提取胸肌和腿肌的總RNA。利用核酸蛋白儀和瓊脂糖電泳測(cè)定RNA濃度和純度，RNA濃度要求在A260/A280 1.8～2.0之間可以使用，提取的總RNA置于-80℃冰箱中保存。

1.6 引物的設(shè)計(jì)與合成

μ-Calpain基因與β-actin基因序列從GenBank中檢索獲得,基因號(hào)分別為NM_205303和L08165。用primer軟件設(shè)計(jì)，探針（Probe）5'CAATGGCTCCGGTATGTGCAAGGC3'，其中5'端標(biāo)記FAM，3'端標(biāo)記TEMRA，引物與探針由北京華大基因工程公司合成。其引物序列見(jiàn)表2。

表2 基因的引物的序列和擴(kuò)增大小

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

反應(yīng)參照TOYOBO公司ReverTra Ace Qpcr RT Kit試劑盒進(jìn)行，取肌肉組織中的總RNA 2 μl、RT Buffer 4 μl、RT Enzyme Mix 1μl、Primer Mix 1 μl，其余試劑按試劑盒要求加入PCR管中，反應(yīng)體系為20μl，反應(yīng)程序?yàn)椋?7℃15 min、98℃5 min。反應(yīng)產(chǎn)物置于-20℃冰箱保存。RT反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行PCR反應(yīng)，將RT反應(yīng)的產(chǎn)物應(yīng)用為PCR模板。實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法參照實(shí)時(shí)熒光定量MaximaProbe/ROX qPCR Master Mix，使用ABI step one_plus Real-time RCR System進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系為25 μl。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10 s、95℃變性5 s、45.5℃退火20 s、72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)后產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS（16.0）軟件進(jìn)行雙因素方差分析，用Duncan's法多重比較分析組間差異顯著。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本總RNA提取結(jié)果(見(jiàn)圖1)

組織提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，A260/A280在1.8～2.0之間，由圖1可知，RNA分子條帶清晰、完整性好、RNA降解低、無(wú)DNA污染，能滿足試驗(yàn)要求。

圖1 樣本總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

以不同拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品重組質(zhì)粒模板的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以PCR反應(yīng)過(guò)程中出現(xiàn)熒光信號(hào)的初始循環(huán)數(shù)(Ct)為縱坐標(biāo)，分別作出β-actin基因與μ-Calpain基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

β-actin基因標(biāo)準(zhǔn)曲線在模板濃度梯度為10-3～10-10的范圍內(nèi)構(gòu)建，β-actin基因標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=-3.233x+36.931，回歸系數(shù)0.995，擴(kuò)增效率103.841。其中Y為Ct值，X為模板量的對(duì)數(shù)值。標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率在理想的90%～105%的范圍內(nèi)，試驗(yàn)重復(fù)性好（見(jiàn)圖2）。

μ-Calpain基因標(biāo)準(zhǔn)曲線在模板濃度梯度為10-3～10-10的范圍內(nèi)構(gòu)建，μ-Calpain基因標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=-3.265 3x+31.343，回歸系數(shù)0.986，擴(kuò)增效率102.204。其中Y為Ct值，X為模板量的對(duì)數(shù)值。標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率在理想的90%～105%的范圍內(nèi)，試驗(yàn)重復(fù)性好(見(jiàn)圖3)。

圖2 β-actin基因標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 μ-Calpain基因標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 目的基因RT-PCR擴(kuò)增曲線

組織Total RNA經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)后系統(tǒng)根據(jù)熒光值的變化規(guī)律，自動(dòng)生成反應(yīng)循環(huán)數(shù)與熒光量變化的擴(kuò)增反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線(見(jiàn)圖4)。

圖4 μ-Calpain mRNA熒光定量PCR循環(huán)數(shù)與熒光強(qiáng)度的關(guān)系曲線

2.4 高鈣日糧對(duì)鵝不同部位肌肉μ-Calpain mRNA表達(dá)量的影響（見(jiàn)表3）

由表3可知，高鈣日糧對(duì)鵝胸肌和腿肌μ-Calpain mRNA表達(dá)量無(wú)顯著影響(P＞0.05)，在不同鈣水平下，胸肌μ-Calpain mRNA表達(dá)量高于腿肌μ-Calpain mRNA表達(dá)量。

表3 高鈣日糧對(duì)鵝不同部位肌肉μ-Calpain mRNA表達(dá)量的影響

2.5 不同屠宰時(shí)間對(duì)鵝不同部位肌肉μ-Calpain mRNA表達(dá)量的影響（見(jiàn)表4）

表4 不同屠宰時(shí)間對(duì)μ-Calpain mRNA表達(dá)量的影響

由表4可知，不同屠宰時(shí)間對(duì)胸肌μ-Calpain mRNA表達(dá)量影響極顯著，且在屠宰第21 d與屠宰第7、14、28 d之間差異極顯著(P＜0.01)，第7、14、28 d之間差異不顯著。胸肌的μ-Calpain mRNA表達(dá)量均高于腿肌μ-Calpain mRNA表達(dá)量。

3 討論

3.1 高鈣日糧對(duì)鵝不同部位肌肉μ-Calpain mRNA表達(dá)量的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加不同鈣水平日糧對(duì)鵝胸肌和腿肌μ-Calpain mRNA表達(dá)量無(wú)顯著影響(P＞0.05)。其原因可能是隨著鈣水平的提高，機(jī)體中吸收Ca2+含量也逐漸增加，然而機(jī)體中Ca2+的吸收存在一定的閾值，通過(guò)體內(nèi)代謝與相關(guān)激素的調(diào)節(jié)，使得鈣含量保持動(dòng)態(tài)的平衡。當(dāng)機(jī)體鈣攝入量不超過(guò)這一閾值時(shí)，機(jī)體鈣含量相對(duì)增加，從而提高了肌肉μ-Calpain mRNA表達(dá)量。但當(dāng)機(jī)體攝入鈣過(guò)多的時(shí)候，吸收機(jī)制受到阻礙，過(guò)多的鈣隨著糞便與尿一同排出體外。另外也有可能在高鈣日糧條件下，吸收較多的Ca2+也有可能激活了Calpastatin，從而抑制了μ-Calpain的活性，即μ-Calpain mRNA表達(dá)量無(wú)顯著變化。在不同鈣水平日糧條件下，胸肌μ-Calpain mRNA表達(dá)量高于腿肌μ-Calpain mRNA表達(dá)量。這與劉安芳[3]研究結(jié)果相一致。劉安芳在雞不同組織中測(cè)定鈣蛋白酶表達(dá)量的試驗(yàn)結(jié)果表明，胸肌μ-Calpain mRNA的表達(dá)量顯著高于腿肌的表達(dá)量。與肖蘞[4]的研究結(jié)果相似，在前42 d測(cè)定山地烏骨雞不同組織μ-Calpain表達(dá)量的結(jié)果顯示，胸肌的表達(dá)量高于腿肌的表達(dá)量。其可能的原因是由于隨著鈣水平的提高，大量Ca2+的攝入造成胸肌中Ca2+的沉積量要大于腿部肌肉Ca2+的沉積量，造成了從整體上來(lái)看胸肌表達(dá)量高于腿肌的表達(dá)量。

3.2 不同屠宰時(shí)間對(duì)鵝不同部位肌肉μ-Calpain mRNA表達(dá)量影響

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，第21 d屠宰的胸肌μ-Calpain mRNA表達(dá)量與第7、14、28 d屠宰之間差異極顯著(P＜0.01)，而第7、14、28 d屠宰的胸肌μ-Calpain mRNA表達(dá)量無(wú)顯著差異(P＞0.05)。不同屠宰時(shí)間對(duì)腿肌μ-Calpain mRNA表達(dá)量無(wú)顯著影響(P＞0.05)。這可能因?yàn)椴煌娘曃箷r(shí)間，機(jī)體吸收的Ca2+在胸肌沉積量有所不同，導(dǎo)致對(duì)μ-Calpain mRNA表達(dá)量影響不同，而腿肌沉積的Ca2+量無(wú)明顯差異，因此對(duì)μ-Calpain mRNA表達(dá)量無(wú)顯著影響。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，鵝不同部位肌肉μ-Calpain mRNA表達(dá)量是不同的，即胸肌μ-Calpain mRNA表達(dá)量均高于腿肌，以第21 d屠宰胸肌與腿肌的差距最大。這可能是由于機(jī)體吸收的Ca2+在不同部位肌肉沉積量是不同的，因而刺激μ-Calpain活性的大小不同，即不同部位肌肉μ-Calpain mRNA表達(dá)量不同，胸肌μ-Calpain mRNA表達(dá)量高于腿肌。

4 結(jié)論

添加不同水平丙酸鈣的日糧對(duì)鵝胸肌和腿肌μ-Calpain mRNA表達(dá)量無(wú)顯著影響。在添加0.9%Ca2+時(shí)，胸肌μ-Calpain mRNA表達(dá)量達(dá)到比較高的水平，1.2%Ca2+對(duì)腿肌μ-Calpain mRNA表達(dá)量影響較大；而以第14 d屠宰對(duì)鵝腿肌μ-Calpain mRNA表達(dá)量影響最大，第21 d屠宰對(duì)鵝胸肌μ-Calpain mRNA表達(dá)量影響最大。

[1] Sorimachi H,Ono Y.Physiological function of calpains[J].Biochemistry，1997，328:721-732.

[2] Sorimachi H,Kinbara K,Kimura S,et al.Muscle-specific Calpain,p94,responsible for limb girdle muscular dystrophy type 2A associates with connection through IS2,a p94 specific sequence[J].Journal of Biological Chemistry,1995,270:31158-31162.

[3] 劉安芳，朱慶，劉益平，等.鈣蛋白酶基因在雞不同組織和品種中的表達(dá)差異[J].中國(guó)畜牧雜志，2007，43（19）:4-7.

[4] 肖蘞，張?jiān)鰳s，黃毅，等.山地烏骨雞不同組織中CAPN 1基因表達(dá)的發(fā)育性變化[J].四川畜牧獸醫(yī)，2010，5（03）:34-37.