雷博

多藥耐藥（MDR）[1]是白血病化療失敗的主要原因，目前已知的多藥耐藥機制還不能完全解釋白血病的MDR現(xiàn)象，因此發(fā)現(xiàn)新的耐藥相關(guān)且共表達的基因是揭示白血病MDR機理、改善化療效果和預(yù)后的迫切需要。我們實驗室應(yīng)用改良的消減雜交技術(shù)以急性白血病耐藥細胞系（HL60/VCR）和敏感細胞系（HL60）為研究對象建立了急性白血病多藥耐藥相關(guān)消減cDNA文庫[2]，篩選出23條表達有差異的基因，經(jīng)查閱文獻和生物信息學(xué)分析，本實驗從中選取熱休克蛋白HSP60基因作為進一步的研究對象，應(yīng)用熒光定量RT-PCR的方法在臨床病例中進行檢測，以分離和確認新的白血病耐藥相關(guān)基因。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

白血病患者39例，選自2008年11月～2009年11月西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液科住院病人，均在本院血液實驗室經(jīng)FAB形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細胞遺傳學(xué)的MIC分型確診，符合造血組織腫瘤新WHO分類標(biāo)準(zhǔn)。其中非淋巴細胞白血病23例（化療敏感者17例，耐藥者6例），淋巴細胞白血病13例（化療敏感者7例；耐藥者6例），急性混合細胞白血病1例（為耐藥者），多發(fā)性骨髓瘤2例（化療敏感者1例，耐藥者1例）。男性20例，女性19例，中位年齡35歲（5～75歲）。同時以6名健康人為對照組，男4例，女2例，中位年齡28歲。（臨床耐藥診斷標(biāo)準(zhǔn)參閱1997年全國難治性白血病研討會所制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)。）

1.2 骨髓和外周血細胞HSP60mRNA表達的實時熒光定量RT-PCR檢測抽取樣本骨髓（臨床患者）或外周血（正常健康人），用淋巴細胞分離液（天津灝洋生物制品公司產(chǎn)品）分離單個核細胞，抽提細胞總RNA，用紫外吸收測定法檢測 RNA濃度和純度，變性瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射光下觀察并拍照。5μg總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA（MBI公司產(chǎn)品），逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為70℃5分鐘,42℃1小時、70℃10分鐘，cDNA溶液儲存于-80℃?zhèn)溆?。HSP60及內(nèi)參β-actin的擴增引物見表1，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

按照SYBR Premix real time PCR Mix（AmpliQ公司）試劑說明檢測HSP60和內(nèi)參β-actin的mRNA表達水平，使用 AB I GeneAmp5700 real time PCR儀完成real time PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5分鐘，然后按94℃30秒，62℃1分鐘，72℃1分鐘，35個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。對每一樣本同時進行3個PCR反應(yīng)檢測，PCR產(chǎn)物在1.2％瓊脂糖凝膠電泳，GoldViewTM染色，以檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶。

表1 引物列表

表2 白血病組與正常對照組HSP60基因表達的比較

表3 耐藥與敏感組HSP60基因表達的比較

表4 HSP60基因在AML與ALL中表達的比較

本研究用比較Ct值相對定量法檢測mRNA表達水平，應(yīng)用公式為：①根據(jù)靶基因和內(nèi)參照基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線用公式Y(jié)=101 /△Ct（△Ct等于靶基因每稀釋10倍時，平均增加的Ct數(shù)）分別計算兩者Ct值每減少1個循環(huán)時對應(yīng)的模板DNA的增加倍數(shù)，求出Y值；②靶基因的相對含量，公式為：Y靶Ct靶基因均值-Ct靶基因（Ct靶基因平均值表示所有樣本中靶基因的Ct值的均數(shù)，Ct靶基因表示不同個體樣本的靶基因Ct值）；③用同一個體的內(nèi)參β-actin對其HSP60的mRNA表達水平做標(biāo)準(zhǔn)化處理，代表這1個個體白血病細胞中靶基因的表達水平，公式為：Y靶標(biāo)準(zhǔn)化=Y靶/Yβ-actin。比較標(biāo)準(zhǔn)化后各組HSP60mRNA的相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

熒光定量PCR結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，原始數(shù)據(jù)用Excel錄入，用Kruskal-wallis H檢驗，組間比較用Mannwhitney U檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

實時熒光定量RT-PCR結(jié)果對所提取總RNA經(jīng)分光光度計檢測，其A260/A280比值均在1.8..2.1之間，經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，溴化乙錠染色，28S、18S、5S帶清晰可見，無明顯降解。根據(jù)靶基因和內(nèi)參照基因β-actin的標(biāo)準(zhǔn)曲線用公式Y(jié)=101/△Ct，計算β-actin和HSP60的Y值近似相同約為2.15。表示各基因Ct值減少1個循環(huán)對應(yīng)的模板DNA的增加倍數(shù)為2.15倍。既然Y值近似相等，那么可以應(yīng)用簡化公式2.15Ct內(nèi)參照基因-Ct靶基因來計算每一樣品每一基因的相對含量，最終得到的值即為此樣品此基因的校正后的相對含量。

從表2可以看出HSP60基因在AL和正常組中的表達量有顯著性差異，白血病組mRNA的表達明顯高于正常組；從表3可以看出HSP60基因在耐藥和敏感組中的表達量有統(tǒng)計學(xué)意義，耐藥組明顯高于敏感組；從表4可以看出HSP60基因在ALL和AML患者中的表達，沒有明顯差異。

3 討論

在白血病的治療中MDR已成為阻礙其療效的一個重要問題，對各種耐藥機制作用的深入研究必將有利于提高化療療效。既往研究已發(fā)現(xiàn)了很多耐藥機制，但以這些分子作為靶點的耐藥逆轉(zhuǎn)研究目前仍存在許多難以克服的問題，繼續(xù)尋找新的耐藥分子靶點仍是當(dāng)前研究的重點。

熱休克蛋白HSP是普遍存在于生物體細胞中的一組高度保守的蛋白質(zhì)，平時表達量很低，在理化因素、病原體及細胞惡變等應(yīng)激狀態(tài)下合成量增加。熱休克蛋白的生物學(xué)功能廣泛，主要通過在應(yīng)激狀態(tài)下保護細胞生命活動必需的蛋白質(zhì)以維持細胞生存，增加細胞耐受性和抗凋亡能力。在腫瘤細胞內(nèi)，熱休克蛋白的大量表達可能由于腫瘤細胞的不斷增殖需要HSP作為分子伴侶來調(diào)節(jié)和穩(wěn)定這一增殖過程[3]。一方面HSP可與多種原癌基因相互作用，影響細胞周期，調(diào)節(jié)細胞增殖；另一方面介導(dǎo)錯配蛋白的降解，協(xié)調(diào)腫瘤細胞的蛋白質(zhì)快速代謝平衡，使腫瘤細胞得以無限增殖。此外，HSP在腫瘤細胞的抗凋亡過程中發(fā)揮著重要作用[4]。正常細胞中僅表達少量HSP參與細胞生長代謝，并受細胞周期的嚴(yán)格調(diào)控，而腫瘤細胞即使在無應(yīng)激條件下，也能獨立于細胞周期持續(xù)高表達HSP，在維持細胞的永生性上起作用。HSP作為分子伴侶在正常細胞中發(fā)揮抵抗應(yīng)激的保護作用，在腫瘤細胞中則表現(xiàn)為對化療的耐受性增強，可能與白血病細胞的多藥耐藥有關(guān)。HSP70、HSP27[5]已有研究證明與AL耐藥相關(guān)，而HSP60[6]作為熱休克蛋白的主要成員其與腫瘤耐藥的研究報道很少。本實驗檢測結(jié)果表明：HSP60基因在AL耐藥組、敏感組和正常對照組間有顯著性差異；白血病組高于正常對照組，與研究報道一致；耐藥組高于敏感組，P＜0.05。ALL患者HSP60mRNA的表達水平高于AML患者，但結(jié)果不具有統(tǒng)計學(xué)意義。

總之，本實驗從cDNA文庫中選取熱休克蛋白HSP60，研究其在臨床病例中的表達情況，在臨床上對AL患者提供化療效果、評判預(yù)后和指導(dǎo)個體化治療的實驗室和理論依據(jù)，同時篩選出新的MDR相關(guān)基因，為發(fā)現(xiàn)白血病MDR發(fā)生的新機制和逆轉(zhuǎn)耐藥治療提供新的途徑和靶點。

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