李春娣 張薇 張玲 徐亞東 鹿愛平

腫瘤嚴(yán)重威脅人類健康，其發(fā)病率和死亡率居各類疾病之首且仍逐年上升?，F(xiàn)臨床通過采用中西藥結(jié)合的方法治療腫瘤來達(dá)到減毒增效的目的。丹參酮ⅡA（tanshinone ⅡA，TanⅡA）藥理作用表現(xiàn)在抗動脈粥樣硬化、縮小心肌梗死面積、降低心肌耗氧量，對血栓形成以及血小板聚集功能有抑制作用[1-3]，且大量體外研究顯示，其對多種腫瘤細(xì)胞具有殺傷、抑制增殖、誘導(dǎo)分化及促進(jìn)凋亡的作用[4-5]。但TanⅡA體內(nèi)的抗癌作用及機(jī)制目前報(bào)道不多，本實(shí)驗(yàn)以Lewis肺癌荷瘤小鼠為研究對象，觀察TanⅡA在體內(nèi)對肺癌生長的抑制作用及對Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響，來進(jìn)一步探討TanⅡA的抗腫瘤機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液（上海第一生化藥業(yè)有限公司（國藥準(zhǔn)字H31022558），規(guī)格為10mg/2mL）。環(huán)磷酰胺（CTX江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，每支200mg，批號06052021，國藥準(zhǔn)字H32020857）。

表1 丹參酮ⅡA對小鼠體內(nèi)Lewis肺癌生長的影響±s，n=10）

表1 丹參酮ⅡA對小鼠體內(nèi)Lewis肺癌生長的影響±s，n=10）

注：與鹽水陰性對照組比較，*P 0.01；與CTX組比較，▲P 0.05，▲▲P＜0.01

組別 瘤重（g） 抑瘤率（％）NS組 3.338±0.201▲▲ 0 TanⅡA組 2.485±0.188*▲▲ 25.65 TanⅡA＋CTX組 1.205±0.385*▲ 58.26 CTX組 1.178±0.982* 50.14

表2 各組Bcl-2、Bax表達(dá)水平比較（x±s）

1.1.2 動物及試劑 C57BL/6純系小鼠，雄性6～8周，（20±2）g，40只，北京維通利華公司動物實(shí)驗(yàn)中心，動物許可證號：SCXK（京）2002-2003。兔抗鼠Bax單克隆抗體、兔抗鼠Bcl-2單克隆抗體（SANTA CRUZ公司）、二步法免疫組化檢測試劑盒，DAB顯示劑（北京中杉金橋公司）。

1.1.3 瘤株Lewis 肺癌，Lewis肺癌荷瘤鼠由中科院腫瘤研究所提供并傳代保種；動物許可證號：SCXK（京）2004-0001，Lewis 肺癌維持在C57BL/6小鼠體內(nèi)，每2周傳代1次。

1.2 方法 將40只雄性C57BL/6純系小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，右腋皮下接種肺癌瘤株細(xì)胞，建立lewis肺癌小鼠模型，從接種腫瘤次日開始，分別腹腔注射給藥：TanⅡA組：15mg/（kg·d），連續(xù)給藥10d；生理鹽水（NS）組：0.9％生理鹽水0.2mL，連續(xù)10d；環(huán)磷酰胺組（CTX）：25mg/（kg·d），隔日給藥一次，共5次；TanⅡA+CTX組：按TanⅡA 15mg/（kg·d）連續(xù)給藥10d，于接種瘤細(xì)胞后24h隔日一次給予CTX 25mg/kg共5次。末次給藥后24h，小鼠稱重，處死。

1.3 觀察指標(biāo)與測定方法

1.3.1 瘤重 末次給藥后24h將小鼠稱重，斷頸處死，剝?nèi)×鰤K稱重。抑瘤率（％）=（模型組平均瘤重-治療組平均瘤重）/模型組平均瘤重×100％。

1.3.2 丹參酮ⅡA對Lewis肺癌Bcl-2、Bax表達(dá)的影響 免疫組化法測定Bcl-2、Bax表達(dá)。瘤塊以石蠟包埋制成4μm厚的切片，脫蠟、水化后，3％H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，高壓抗原修復(fù)，后續(xù)步驟按照二步法免疫組化檢測試劑盒說明書操作。陰性對照以0.01mol/L PBS（pH=7.4）代替一抗。在光學(xué)顯微鏡下觀察鹽水對照組和各給藥實(shí)驗(yàn)組樣本的免疫組化切片。

1.3.3 結(jié)果判定 每張切片在5～10個高倍視野下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個視野計(jì)數(shù)100～200個細(xì)胞，共1000個細(xì)胞，計(jì)算每張切片陽性細(xì)胞數(shù)所占比例。Bcl-2在胞漿出現(xiàn)棕黃色染色為陽性染色。Bax在胞漿和（或）胞膜出現(xiàn)棕黃色染色為陽性染色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組藥物對Lewis肺癌實(shí)體瘤的影響

結(jié)果顯示TanⅡA組的瘤重和瘤大小均明顯小于鹽水對照組（P＜0.01），抑制瘤率為25.65％；TanⅡA＋CTX組抑瘤率為58.26％，高于CTX組的抑瘤率50.14％（見表1）。故提示TanⅡA對小鼠體內(nèi)Lewis肺癌生長具有抑制作用，TanⅡA聯(lián)合CTX組的抑瘤率高于單用CTX。

2.2 各組藥物對Lewis肺癌Bcl-2及Bax表達(dá)的影響 結(jié)果表明，與鹽水對照組相比，TanⅡA組及TanⅡA+CTX組的Bcl-2表達(dá)明顯降低；Bax表達(dá)明顯升高，結(jié)果有顯著性差異（見表2）。

3 討論

肺癌的發(fā)生是一個涉及多因素多階段的復(fù)雜過程，近年來研究表明，肺癌的發(fā)生可能是由于細(xì)胞凋亡與增殖失衡造成的。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞自身的一種主動的、生理性死亡機(jī)制，細(xì)胞調(diào)亡過程受促調(diào)亡因子和調(diào)亡抑制因子的共同調(diào)節(jié)。其中Bcl-2和Bax屬于Bcl-2同一家族，是Tsujimoto和oltvai發(fā)現(xiàn)的與人類多種腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系的基因。Bcl-2是從人類濾泡型非霍奇金B(yǎng)細(xì)胞淋巴瘤克隆到的原癌基因，其通過穩(wěn)定線粒體膜的功能，阻止線粒體釋放Caspase、凋亡誘導(dǎo)因子和細(xì)胞色素C等作用抑制細(xì)胞凋亡[6]。Bcl-2通過抑制細(xì)胞凋亡而參與腫瘤的發(fā)生。Bax基因具有拮抗Bcl-2的作用，是促凋亡基因。當(dāng)Bax蛋白大量表達(dá)，并與Bcl-2蛋白形成異源二聚體時(shí)加速細(xì)胞死亡，Bcl-2和Bax的表達(dá)程度對決定細(xì)胞接受凋亡信號后存活與否起關(guān)鍵作用。目前，多數(shù)研究表明，Bcl-2與Bax的表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)，Bcl-2過量表達(dá)，細(xì)胞存活；Bax蛋白過量表達(dá)，細(xì)胞死亡。

本研究結(jié)果顯示TanⅡA對荷瘤小鼠腫瘤的生長有一定的抑制作用，且可顯著提高環(huán)磷酰胺的抑瘤作用。免疫組化結(jié)果顯示，與鹽水組比較，TanⅡA組及TanⅡA＋CTX組的Bcl-2表達(dá)明顯降低，Bax表達(dá)明顯升高。表明TanⅡA可下調(diào)Bcl-2和上調(diào)Bax表達(dá)，提示TanⅡA誘導(dǎo)小鼠Lewis肺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能是通過下調(diào)Bcl-2表達(dá)和增強(qiáng)Bax表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的；且與環(huán)磷酰胺聯(lián)用有協(xié)同作用。

[1]張玉芳,趙春景.丹參酮ⅡA及其鈉鹽的藥理研究進(jìn)展[J].中國藥業(yè),2008,17（1）：1.

[2]石遠(yuǎn),姜同英,王思玲.丹參酮ⅡA及其制劑開發(fā)[J].世界臨床醫(yī)藥,2007,28（7）：439.

[3]Huang X,Zhang YM.Cardiovascular pharmacology of tanshinoneⅡA sulfonate[J].Foreign Medical Sciences[J].Traditional Chinese Med edit,1995,17（1）：9.

[4]梁勇,羊裔明,袁淑蘭.丹參酮藥理作用及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中草藥,2000,1（4）：304.

[5]Wu Y,Yang YM,Meng WT.Induced differentiation effect of tanshinoneⅡA on K562 cell lines[J].JWCUMS,2002,33（1）：77.

[6]Fiskum G.Mitochondrial participation in ischemic and raumatic neuronal cell death[J].Neurotrauma,2000,17（7）：843-845.