陳艷華

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，目前主要的治療方法是手術(shù)和化療。但是對(duì)于晚期結(jié)腸癌，無(wú)法手術(shù)，化療療效欠佳，尋求高效、低毒的化療藥物迫在眉睫。羅格列酮（Rosiglitazone，ROZ）為過(guò)氧化物酶體增殖因子活化受體（Peroxisome proliferator activated receptors，PPARs）的合成配體，是一類(lèi)新的抗糖尿病藥物。近年研究表明，ROZ可以通過(guò)誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞分化、凋亡來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，如乳腺癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌[1-3]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討ROZ對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29生長(zhǎng)抑制和誘導(dǎo)凋亡作用。

1 試劑與方法

1.1 藥品與試劑 ROZ由浙江萬(wàn)馬公司提供。用DMSO配成5mmol/l抽濾滅菌后-20℃貯存?zhèn)溆谩?氟尿嘧啶購(gòu)自浙江海門(mén)制藥廠，用PBS配成1g/L，-20℃貯存?zhèn)溆?。MTT（四氮甲基四唑藍(lán)）均為Sigma產(chǎn)品。小牛血清為杭州四季青產(chǎn)品。RPMI-1640購(gòu)自GIBCOBRL公司。

1.2 細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29由中國(guó)典型培養(yǎng)物中心引進(jìn)，用10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃，5％CO2溫箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測(cè)ROZ對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成4×105/ml單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞的懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μl，含細(xì)胞數(shù)4×104/ml，置入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，給藥組每孔加入100ul藥液。調(diào)零組和對(duì)照組加入相同體積PBS，每組設(shè)3個(gè)平行孔。培養(yǎng)72h后每孔加入用PBS配制的MTT（5μg/L）20μl（調(diào)零組除外），再培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜（DMSO）100μl/孔。待甲瓚完全溶解后用EXL-800UV全自動(dòng)酶聯(lián)免疫儀在波長(zhǎng)570nm處調(diào)零后讀取吸光度A值。取3孔的均數(shù)，按公式細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（IR）=（1-試驗(yàn)孔A值/對(duì)照孔A均值）×100％，計(jì)算IR值，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

表1 MTT比色法測(cè)定ROZ對(duì)HT-29細(xì)胞增殖活性的作用（SD，n＝4，72h）

表2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROZ對(duì)HT-29細(xì)胞凋亡的影響±s n=3）

表2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROZ對(duì)HT-29細(xì)胞凋亡的影響±s n=3）

注：*與對(duì)照組比較P＜0.05，#與25μmol/LROZ組比較，P＜0.05，△與12.0μg/mL5-FU比較P＜0.05

分組 藥物濃度（μmol/L） 凋亡率（％）空白對(duì)照組 0 1.82±0.26 5-FU 12.0μg/mL 31.06±0.99* ROZ組 25 8.36±0.21* 50 21.2±0.69*# 100 41.6±1.56*#△

2 結(jié)果

2.1 MTT比色法測(cè)定ROZ、5-Fu對(duì)HT-29細(xì)胞增殖活性的影響用0.6、5.0、25.0、50.0、100.0μmol/LROZ處理細(xì)胞72h，其對(duì)HT-29細(xì)胞的抑制率分別是5.25％，8.69％，12.98％，31.02％，55.68％，呈藥物濃度依賴方式，但ROZ 50μmol/L及以下濃度時(shí)，HT-29細(xì)胞增殖和相對(duì)抑制率小于20％，提示此濃度范圍的ROZ無(wú)細(xì)胞毒性。當(dāng)用12.0μg/ml氟尿嘧啶處理細(xì)胞72h，其對(duì)HT-29細(xì)胞的抑制率56.58％。ROZ對(duì)HT-29細(xì)胞增殖抑制的IC50為136.1μmol/L；表明ROZ具有抑制HT-29細(xì)胞作用。100μmol/LROZ與陽(yáng)性藥物12.0μg/ml氟尿嘧啶比較抑制作用接近（見(jiàn)表1）。

2.2 ROZ、5-Fu對(duì)HT-29細(xì)胞凋亡的影響

ROZ對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，流式細(xì)胞術(shù)顯示HT-29細(xì)胞的自然凋亡率為（1.82±0.26）％，25.0μmol/L的ROZ與細(xì)胞作用72h后，細(xì)胞凋亡率為（8.36±0.21）％，提示25.0μmol/L的ROZ并不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。50，100μmol/L的ROZ作用HT-29細(xì)胞凋亡率增加至21.2％，41.6％，與空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其凋亡率均有增加（見(jiàn)表2）。

3 討論

PPARs是一組具有復(fù)雜功能的核受體超家族成員。PPARs與脂肪形成、糖代謝、炎癥及腫瘤發(fā)生等多種生物過(guò)程有關(guān)。ROZ為一種噻唑烷二酮類(lèi)藥物，是PPARγ的人工合成配體。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)[4-5]，PPARγ在多種腫瘤細(xì)胞如乳腺癌，前列腺癌，肺癌，急性白血病等表達(dá)，噻唑烷二酮類(lèi)藥物處理上述細(xì)胞，可通過(guò)誘導(dǎo)分化和（或）凋亡來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。

ROZ人體血藥峰值濃度為1.67μmol/L。本實(shí)驗(yàn)MTT及用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，低濃度（0.6、5.0、25.0μmol/L）ROZ對(duì)HT-29細(xì)胞增殖和相對(duì)抑制率小于20％，提示此濃度范圍的ROZ無(wú)細(xì)胞毒性。50、100μmol/L ROZ體外可抑制HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)，本實(shí)驗(yàn)流式細(xì)胞術(shù)100μmol/L的ROZ作用HT-29細(xì)胞凋亡率增加至41.6％，誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡。提示ROZ能抑制HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的濃度較高，單用ROZ體內(nèi)血藥濃度難以達(dá)到抗腫瘤作用，可能需要通過(guò)與化療藥物合用降低化療藥物劑量，從而減少化療藥物的副作用、減少耐藥性而達(dá)到抗腫瘤作用。這為研發(fā)化療增敏藥物提供很好的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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