王慧，竇文芳，張曉梅，許泓瑜，許正宏,2

1 江南大學(xué) 醫(yī)藥學(xué)院制藥工程研究室，無錫 214122

2 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122

胰高血糖素樣多肽1 (Glucagon-like peptide-1，GLP-1) 是由腸道L細(xì)胞合成和分泌的一個由30個氨基酸組成的具有促進(jìn)胰島素分泌功能的多肽，體內(nèi)外研究顯示GLP-1能增強(qiáng)葡萄糖依賴性的胰島素分泌，減少食物的攝取，減慢胃的排空，以及抑制胰高血糖素的分泌、刺激胰 β細(xì)胞增殖，促進(jìn)胰島再生，又能抑制胰β細(xì)胞的凋亡，是現(xiàn)有糖尿病藥物無可比擬的[1-4]。但是，由于 GLP-1在體內(nèi)易被二肽酰基肽酶Ⅳ (DPPⅣ) 降解和腎臟清除導(dǎo)致半衰期很短，限制了其臨床應(yīng)用[5]。為克服該缺點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)室前期通過重疊PCR將兩個GLP-1突變串聯(lián)體分子與一個人血清白蛋白HSA分子融合 (ggh)，并實(shí)現(xiàn)了其在巴斯德畢赤酵母 Pichia pastoris中的表達(dá)[6]。

pPIC9K和 pPICZαB同屬于巴斯德畢赤酵母分泌型表達(dá)載體，可以通過同源重組的方式分別在畢赤酵母基因組HIS4位點(diǎn)與AOX1位點(diǎn)進(jìn)行整合，實(shí)現(xiàn)在同一宿主菌中的共表達(dá)，從而提高目標(biāo)蛋白在畢赤酵母中的基因劑量，在一定范圍內(nèi)可以提高目標(biāo)蛋白的表達(dá)量。Williams等將 pPIC9K和pPICZαA質(zhì)粒同時整合到畢赤酵母GS115中，建立雙質(zhì)粒共表達(dá)體系，從而提高了明膠在畢赤酵母GS115中的表達(dá)量，由原來的 54.4 mg/L提高至80.2 mg/L[7]。

本實(shí)驗(yàn)室前期將 GGH基因克隆到畢赤酵母分泌型表達(dá)質(zhì)粒 pPIC9K，構(gòu)建了重組菌 GS115/F2，搖瓶培養(yǎng)80 h其目的蛋白表達(dá)量達(dá)到328 mg/L[8]。本研究通過構(gòu)建pPIC9K和pPICZαB雙質(zhì)粒共表達(dá)體系，進(jìn)一步提高了融合蛋白GGH在畢赤酵母中的表達(dá)量，為該藥物分子的規(guī)模化制備奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌體和載體

大腸桿菌E. coli JM109由本實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒pPIC9K-ggh、pMD19-T-gapdh和畢赤酵母表達(dá)菌株 GS115/F2由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；pPICZαB購自 Invitrogen公司；pMD19-T Simple Vector為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑

各種限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA和蛋白Marker等購自TaKaRa公司，質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒均購自上海捷瑞生物有限公司，酵母氮基、Zeocin、HRP-DAB底物顯色液等均為上海生工產(chǎn)品，GLP-1和 HSA單克隆抗體等購自優(yōu)寧維公司，引物由上海捷瑞生物有限公司合成，其余試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酵母表達(dá)載體pPICZαB-ggh的構(gòu)建

設(shè)計合成分別帶有KpnⅠ和 NotⅠ兩種酶切位點(diǎn)的GGH引物，引物P1、P2序列見表1 (下劃線所示為酶切位點(diǎn))。以 pPIC9K-ggh為模板，P1、P2為引物，擴(kuò)增出5′端和3′端分別帶有KpnⅠ和NotⅠ兩種酶切位點(diǎn)的 ggh基因，然后和 pMD19-T Simple Vector相連轉(zhuǎn)化至E. coli JM109，用含有100 mg/L Amp的LB平板篩選陽性克隆驗(yàn)證，并抽提質(zhì)粒用 KpnⅠ和 NotⅠ雙酶切后連接至畢赤酵母表達(dá)載體 pPICZαB中，重組表達(dá)載體pPICZαB-ggh轉(zhuǎn)化至E. coli JM109，用含有25 mg/LZeocin的LB平板篩選陽性克隆，并進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定。

表1 本研究中所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的線性化和電轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞

取 5~10 μg鑒定和測序正確的 pPICZαB-ggh重組表達(dá)質(zhì)粒，用 PmeⅠ單酶切使之線性化，瓊脂糖凝膠電泳回收5.6 kb片段，?20 ℃保存?zhèn)溆?。參考相關(guān)文獻(xiàn)制備畢赤酵母GS115/F2感受態(tài)細(xì)胞[9]，分別取 80 μL和 5 μL的線性化的重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαB-ggh混合，用 Bio-Rad電轉(zhuǎn)儀于參數(shù)1.5 kV、25 μF、200 ?、時間常數(shù)5 ms進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，立即加入l mL 1 mol/L冰浴山梨醇，在30 ℃條件下孵育2 h。取200 μL涂布于含有1 000 μg/mL Zeocin的MD平板上，30 ℃培養(yǎng)2~3 d至出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子。

1.2.3 免疫斑點(diǎn)法篩選高表達(dá)菌株

將0.45 μm的醋酸纖維素薄膜平置于長有菌落的含有1 000 mg/L Zeocin的MD平板上，用涂布棒輕壓使醋酸纖維素薄膜完全濕潤并趕盡氣泡，使所有菌落轉(zhuǎn)移到醋酸纖維素薄膜上，并在BMMY平板上置同樣大小的0.22 μm的硝酸纖維素薄膜，趕出氣泡，將醋酸纖維素薄膜菌落面向上置于硝酸纖維素薄膜上，30 ℃培養(yǎng)80 h，將上層醋酸纖維素薄膜轉(zhuǎn)移至MD平板上，4 ℃保存。將下層硝酸纖維素薄膜取出，5%脫脂奶封閉 2 h或 4 ℃過夜，用TBST (含有0.05%吐溫-20的TBS) 洗膜5 min，重復(fù)3次，用兔抗人血清白蛋白多抗37 ℃孵育2 h，用TBST洗膜5 min，重復(fù)3次，再用二抗結(jié)合，37 ℃孵育2 h，用TBST洗膜5 min，重復(fù)3次，加入新鮮配置的DAB顯色液，染色5 min后用TBST清洗，挑選出染色顏色較深的菌落進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)和誘導(dǎo)。

1.2.4 誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物分析

挑取膜上顏色由深到淺的單菌落接種于10 mL的YPD培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，5%接種量轉(zhuǎn)接到裝有60 mL含3%甘油的BMGY培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，初始OD600為1，30 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，24 h后離心收集菌體，用20 mL含有3%甲醇的BMMY培養(yǎng)基重懸菌體后誘導(dǎo)表達(dá)，每隔24小時補(bǔ)加甲醇至終濃度為 3%，甲醇誘導(dǎo) 80 h后OD600約為200，10 000 r/min離心10 min，收集上清，用尿微量白蛋白試劑盒測發(fā)酵上清液中的目的蛋白含量[6]，發(fā)酵液離心后取上清等體積進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.5 重組畢赤酵母基因組的提取和PCR鑒定陽性克隆

提取高產(chǎn)菌GS115/F3和出發(fā)菌株GS115/F2的基因組DNA，加入RNase A消除RNA的干擾。以pPICZαB質(zhì)粒上的抗性基因，即Zeocin基因?yàn)閿U(kuò)增目的片段設(shè)計引物P3、P4，序列見表1，對提取的酵母基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。

1.2.6 Q-PCR鑒定高產(chǎn)菌的目的基因拷貝數(shù)

以三磷酸甘油醛脫氫酶基因 (gapdh) 為內(nèi)源參照基因。根據(jù)引物設(shè)計軟件 Primer 5設(shè)計基因gapdh (P5、P6)、ggh (P7、P8) 片段引物 (表1)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收基因片段并與pMD19-T質(zhì)粒相連，建立單拷貝的重組質(zhì)粒，即pMD19-T-gapdh質(zhì)粒和 pMD19-T-ggh質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 JM109中，驗(yàn)證并提取重組質(zhì)粒，通過梯度稀釋，從而建立了gapdh基因和ggh基因的循環(huán)數(shù) (Ct值) 與起始模板數(shù)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線。Q-PCR的條件是：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，讀板，40次循環(huán)；72 ℃終延伸5 min；65 ℃到94 ℃繪制熔解度曲線，每0.5 ℃讀板1次，1次1 s；16 ℃保溫至結(jié)束。Q-PCR的體系是：模板 0.5 μL，引物各 0.2 μL，SYBR 12.5 μL，ddH2O 11.6 μL。

以 gapdh為參照基因，檢測待測樣品中的 ggh基因表達(dá)水平的差異，以原始菌株GS115/F2為校準(zhǔn)樣本，以高產(chǎn)菌株GS115/F3為待測樣本，比較待測樣本相對校準(zhǔn)樣本的表達(dá)差異。利用 2?△△Ct法對其分析。

1.2.7 Western blotting鑒定融合蛋白的表達(dá)

將原始出發(fā)菌株GS115/F2和高產(chǎn)菌株GS115/F3的發(fā)酵液離心取上清，200 V電壓下進(jìn)行SDS-PAGE電泳，100 V電壓下轉(zhuǎn)膜60 min至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，TBST洗膜3次，分別加入鼠抗人血清白蛋白單抗和鼠抗人GLP-1單抗結(jié)合 (抗體均以1∶1 000稀釋)，37 ℃孵育2 h，去除抗體，TBST洗膜3次。再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠的二抗 (1∶1 000稀釋)，37 ℃下孵育2 h，去除二抗，TBST洗膜3次之后，加DAB顯色。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)載體pPICZαB-ggh的構(gòu)建及鑒定

構(gòu)建了含有 ggh基因的畢赤酵母重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαB-ggh，構(gòu)建流程如圖1所示，然后對其進(jìn)行PCR及 KpnⅠ/NotⅠ雙酶切鑒定 (圖略)。重組的pPICZαB-ggh經(jīng)PCR及雙酶切都可以得到大小為2 000 bp左右的DNA片段，測序結(jié)果顯示DNA序列無突變，表明重組表達(dá)載體pPICZαB-ggh構(gòu)建成功。

2.2 免疫學(xué)方法篩選高產(chǎn)菌株

將線性化的重組質(zhì)粒pPICZαB-ggh電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115/F2感受態(tài)細(xì)胞，30 ℃培養(yǎng)2~3 d后在每塊平板的上層醋酸纖維素膜上長出約100~1 000個左右轉(zhuǎn)化子。將上層醋酸纖維素薄膜轉(zhuǎn)移至MD平板上，4 ℃保存。取下層的硝酸纖維素薄膜進(jìn)行免疫顯色，鑒定轉(zhuǎn)化子的表達(dá)水平的高低，結(jié)果見圖2。每個染色點(diǎn)對應(yīng)于上層醋酸纖維素薄膜上的相應(yīng)菌落，從圖 2可以看出不同菌落的顯色強(qiáng)度有明顯差異。挑取圖 2上箭頭所指顏色由深到淺的順序?qū)?yīng)的單菌落進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，取發(fā)酵上清進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖 3。從圖 3可以看出免疫顯色深的斑點(diǎn)對應(yīng)的菌落的表達(dá)量明顯高于免疫顯色淺的斑點(diǎn)對應(yīng)的菌落，并利用此方法獲得一株融合蛋白GGH高表達(dá)菌落GS115/F3。

圖1 重組質(zhì)粒pPICZαB-ggh的構(gòu)建Fig. 1 Construction of the recombinant plasmid pPICZαB-ggh.

圖2 免疫學(xué)方法篩選結(jié)果Fig. 2 Tansformants screend with immunology method. Several intensely stained colonies are indicated with arrows.

圖3 SDS-PAGE分析不同菌株誘導(dǎo)72 h表達(dá)的GGHFig. 3 SDS-PAGE annlysis of GGH expressed in Pichia pastoris. M: protein marker; 1?9: SDS-PAGE analysis of shake flask supernatant of eight transformants screened with two-layer membrane method.

考察了GS115/F3和GS115/F2在搖瓶中的發(fā)酵過程，結(jié)果如圖4所示，生長24 h后用甲醇誘導(dǎo)，兩株菌在生長方面并沒有明顯的差異，但是其外源蛋白的表達(dá)量卻有顯著的差異，OD600為 200時GS115/F3和 GS115/F2的表達(dá)量分別為328 mg/L和491 mg/L，單位OD的菌體融合蛋白的表達(dá)量提高了49.7%。

2.3 Q-PCR確定高產(chǎn)菌的基因拷貝數(shù)

為考察融合蛋白表達(dá)量的增加是否由基因拷貝數(shù)的增加引起的，提取 pMD19-T-pagdh質(zhì)粒和pMD19-T-ggh質(zhì)粒，分別稀釋8個梯度，同時進(jìn)行熒光定量 PCR，反應(yīng)結(jié)束后，程序自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解度曲線，gapdh標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=?0.2925x+ 2.14，r2=0.999，ggh標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=?0.3506x+3.22，r2=0.996，樣品曲線落在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍之內(nèi)，反應(yīng)的熔解峰單一，熒光定量PCR的引物特異性較高。應(yīng)用2?△△Ct法分析得到的高產(chǎn)菌GS115/F3和出發(fā)菌株GS115/F2相比，基因劑量提高了 26.7%，尿微量白蛋白試劑盒測試融合蛋白產(chǎn)量提高了49.7%。

圖4 GS115/F2和GS115/F3的生長曲線和融合蛋白表達(dá)曲線Fig. 4 Cell growth curve and fusion expression curve of GS115/F2 and GS115/F3.

2.4 Western blotting鑒定融合蛋白的表達(dá)

為鑒定經(jīng)雙質(zhì)粒體系改造的高表達(dá)菌株GS115/F3表達(dá)的融合蛋白 GGH 與出發(fā)菌株GS115/F2是否一致，用人白蛋白一抗和人胰高血糖素樣肽-1一抗對其進(jìn)行Western blotting鑒定，如圖5所示，表達(dá)宿主經(jīng)雙質(zhì)粒體系改造前后蛋白質(zhì)的分子量均是7.3 kDa，表明宿主菌株的改造沒有影響融合蛋白的特性，融合蛋白GGH同時具有人白蛋白和人胰高血糖素樣肽-1的免疫原性。在66.4 kDa和44.3 kDa中間出現(xiàn)的一個陽性條帶，經(jīng)測序是GGH的降解條帶。

3 討論

為了從大量重組菌中篩選得到高產(chǎn)菌，本實(shí)驗(yàn)將免疫斑點(diǎn)法[10]結(jié)合高濃度抗生素平板對其進(jìn)行篩選，抗生素平板上生長的菌落影印在醋酸纖維素薄膜上，誘導(dǎo)分泌的蛋白透過醋酸纖維素膜結(jié)合在硝酸纖維素膜上。免疫斑點(diǎn)法選用免疫方法對酵母的分泌蛋白進(jìn)行檢測，篩選高表達(dá)的轉(zhuǎn)化子，且每次可同時篩選幾百個轉(zhuǎn)化子，免疫顯色后各菌落的外泌蛋白量之間的對比明顯、直觀，可以直接挑選染色較深的單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)。這個方法簡化了篩選高產(chǎn)菌株的工作量，并且可靠性更高。因?yàn)楦邼舛鹊目股乜剐栽诤芏嗲闆r并不能真實(shí)反映表達(dá)量，某些拷貝在整合時目的基因可能丟失，僅剩下抗生素抗性，出現(xiàn)假陽性。結(jié)果表明，所篩選的高表達(dá)菌落與實(shí)際液體培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)情況相符。免疫斑點(diǎn)法篩選的特點(diǎn)是必須應(yīng)用已知蛋白的相應(yīng)抗體進(jìn)行篩選，因此，對于尚無抗體的新蛋白或者比較昂貴的抗體應(yīng)用較難。

圖5 (GLP-1A2G)2-HAS融合蛋白的Western blotting鑒定Fig. 5 Western blotting analysis of (GLP-1A2G)2-HSA. M: protein marker; 1: fusion protein of GS115/F3 hybridized with GLP-1 monoclone antibody; 2: fusion protein of GS115/F2 hybridized with GLP-1 monoclone antibody; 3: fusion protein of GS115/F3 hybridized with HSA monoclone antibody; 4: fusion protein of GS115/F2 hybridized with HSA monoclone antibody.

在任何表達(dá)系統(tǒng)中外源蛋白的表達(dá)水平受多種因素的影響。畢赤酵母中宿主表型、基因劑量、外源基因特性、外源蛋白的理化性質(zhì)和發(fā)酵條件的優(yōu)化控制等都是影響蛋白質(zhì)表達(dá)水平的重要因素。有報道在畢赤酵母中增加目的基因的拷貝數(shù)可以提高外源蛋白的表達(dá)量[11]，人血清白蛋白的分泌量和基因劑量呈正相關(guān)在菌株克魯維氏酵母 Kluyveromyces中早已被驗(yàn)證[12]。一般提高基因劑量的方法大部分都是通過在體外構(gòu)建多拷貝的目的基因串聯(lián)以同源重組的方式整合到酵母基因組中，然后通過高濃度的抗生素來篩選高表達(dá)的轉(zhuǎn)化子；Marx等將質(zhì)粒整合到畢赤酵母核糖體 DNA位點(diǎn)上，利用結(jié)合核糖體DNA有效轉(zhuǎn)錄的特點(diǎn)，將血清白蛋白HSA基因在畢赤酵母中的轉(zhuǎn)錄效率提高了40%[13]。本研究證明了兩次電轉(zhuǎn)攜帶有同種目的基因的不同分泌型表達(dá)質(zhì)粒，通過高濃度的抗生素結(jié)合免疫法篩選，不僅可以提高目的基因的拷貝數(shù)，并且在一定范圍內(nèi)提高了外源蛋白的表達(dá)量。這種雙質(zhì)粒共表達(dá)體系不僅可以提高單一蛋白在宿主中的表達(dá)量，還可以實(shí)現(xiàn)兩種不同的蛋白在同一宿主中的共表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)通過建立雙質(zhì)粒共表達(dá)體系提高融合蛋白GGH在畢赤酵母中的表達(dá)，然后通過高濃度的抗生素抗性結(jié)合免疫斑點(diǎn)法進(jìn)行高通量的篩選，獲得的高產(chǎn)菌GS115/F3融合蛋白的表達(dá)量將近提高了一半，和出發(fā)菌株GS115/F2相比表達(dá)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)一致。影響外源蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)因素還很多，它不僅受外源基因特性的影響，也受到宿主菌、Mut表型、酶切和糖基化及培養(yǎng)條件的影響，所以應(yīng)從影響畢赤酵母蛋白表達(dá)的多種因素著手提高融合蛋白GGH的表達(dá)量，實(shí)現(xiàn)規(guī)模化制備。

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