解慶凡 王建華 王曉貞 郭文平 張一昕

1河北省邢臺(tái)市人民醫(yī)院（河北邢臺(tái)054031）

2河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院（河北石家莊050000）

脂脈寧為本課題組自行研制的治療酒精性脂肪肝（alcoholic fatty liver，AFL）的中藥制劑，經(jīng)多年臨床運(yùn)用證實(shí)，療效確切［1］。據(jù)報(bào)道，氧應(yīng)激與脂質(zhì)過(guò)氧化損傷是AFL形成和發(fā)展的一個(gè)重要因素［2］。為了探討脂脈寧的作用機(jī)理，筆者觀(guān)察了其對(duì)AFL模型大鼠血清和肝組織超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量的影響。

1 材 料

1.1 動(dòng)物 健康wistar大鼠70只，雄性，清潔級(jí)，體質(zhì)量160～180g，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（合格證號(hào)：1003046）。

1.2 藥物 脂脈寧膠囊：澤瀉、姜黃、山楂、石菖蒲、白術(shù)、皂角刺、大黃、何首烏等；由筆者所在醫(yī)院制劑室制備，實(shí)驗(yàn)時(shí)用蒸餾水配制成所需濃度。東寶肝泰片為通化東寶藥業(yè)股份有限公司出品，批號(hào)為H22024764；實(shí)驗(yàn)時(shí)用0.5%的羧甲基纖維素鈉配制成所需濃度的混懸液。

1.3 試劑 天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）試劑盒均由北京中生生物工程高技術(shù)公司提供；SOD試劑盒、MDA試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；膽固醇、膽鹽均購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；體積分?jǐn)?shù)56%紅星二鍋頭白酒（北京紅星二鍋頭酒廠(chǎng)生產(chǎn)）。

1.4 主要儀器 半自動(dòng)生化分析儀（德國(guó)毫邁克公司）、722型光柵分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、MSE-25型高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)）、LAUDA-C3型循環(huán)恒溫水浴箱（泰克儀器有限公司）、日本日立H-7500型透射電子顯微鏡。

2 方 法

2.1 動(dòng)物分組 將大鼠飼養(yǎng)于18～22℃明暗各12h的清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。正常喂養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組：正常組、模型組、脂脈寧高、低劑量組、東寶肝泰對(duì)照組。除正常組10只外，其余各組均為15只大鼠。

2.2 造模與給藥 正常組用蒸餾水灌胃，進(jìn)食普通飼料，自由飲水。其余各組參照文獻(xiàn)［3-4］造模：用體積分?jǐn)?shù)56%紅星二鍋頭灌胃，體積分?jǐn)?shù)從30%逐漸升至56%，梯度為每周升高5%，于第6周直接升至56%，并持續(xù)至第8周，同時(shí)喂飼高脂飼料（由1.5%膽固醇、0.5%膽鹽、10%豬油和88%基礎(chǔ)飼料制成），自由飲水。大鼠造模的同時(shí)各組分別給予相應(yīng)藥物灌胃，給藥劑量按藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)計(jì)算，脂脈寧高、低劑量組分別按2.0、1.0g/kg灌服脂脈寧，對(duì)照組按0.9g/kg灌服東寶甘泰片，正常組和模型組灌服蒸餾水，1次/d，每次用藥體積均按1mL/100g計(jì)算，持續(xù)8周。

2.3 標(biāo)本處理 實(shí)驗(yàn)8周末，于最后1次給藥后禁食12h。各組大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，低溫離心，分離血清，密封，-20℃冷存待檢。取血后迅速剖取肝臟，在肝臟最大葉距邊緣0.5cm處取0.5cm×0.5cm大小肝組織，用4%的多聚甲醛固定。另取適量肝組織用冰生理鹽水沖洗，濾紙吸濕后，稱(chēng)取濕質(zhì)量約0.3g，加入預(yù)冷的生理鹽水，冰水中制成10%勻漿，4℃4000r/min離心10min，提取上清液，-20℃冷存待檢。

2.4 檢測(cè)指標(biāo) 肝組織病理形態(tài)學(xué)觀(guān)察：取用4%多聚甲醛固定的肝組織，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀(guān)察。血脂和肝功能檢測(cè)：取血清在半自動(dòng)生化分析儀上測(cè)定TC、TG、AST、ALT的含量或活性。血清和肝組織SOD和MDA的測(cè)定：SOD的檢測(cè)采用黃嘌呤氧化酶法、MDA的檢測(cè)采用硫代巴比妥酸（TBA）比色分析法，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)以表示，采用方差分析、Student-Newman-Keul檢驗(yàn)。血清中SOD活性=（對(duì)照管吸光度-測(cè)定管吸光度）/對(duì)照管吸光度/50%×反應(yīng)液總體積/取樣量）/組織中蛋白含量；組織中SOD活性=（對(duì)照管吸光度-測(cè)定管吸光度）/對(duì)照管吸光度/5%×（反應(yīng)液總體積/取樣量）/組織中蛋白含量。血清中MDA含量=（測(cè)定管吸光度-測(cè)定空白管吸光度）/（標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×樣品測(cè)試前的稀釋倍數(shù)；組織中MDA含量=（測(cè)定管吸光度-測(cè)定空白管吸光度）/（標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度/蛋白含量。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組大鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)變化比較 肉眼可見(jiàn)：正常組肝臟外觀(guān)呈紅褐色，柔軟富有彈性；模型組肝臟體積增大，邊緣鈍而厚，表面及切面呈灰黃色，油膩感；各用藥組之間肉眼觀(guān)察差別不明顯，色澤較暗，質(zhì)地、彈性均介于模型組與正常組之間。HE染色后光鏡下觀(guān)察：正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，中央靜脈大而壁薄，肝細(xì)胞排列成肝索，在中央靜脈周?chē)史派錉罘植?，?xì)胞呈多邊形，無(wú)濁腫、壞死，胞漿無(wú)脂滴，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)不清，肝細(xì)胞索紊亂，肝竇變窄，多數(shù)肝細(xì)胞濁腫、明顯脂肪變性，脂滴以大泡型為主，可見(jiàn)點(diǎn)狀壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。各治療組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞脂肪變性明顯好轉(zhuǎn)，肝細(xì)胞排列整齊，肝竇基本恢復(fù)正常，少量肝細(xì)胞濁腫，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和壞死。

3.2 各組大鼠血清TC、TG、ALT、AST水平比較 見(jiàn)表1。與正常組比較，模型組大鼠血清TC、TG、ALT、AST的含量異常升高（P＜0.01），顯示AFL大鼠存在著明顯的血脂代謝紊亂和肝功能異常。給藥后，脂脈寧高、低劑量組和東寶肝泰對(duì)照組均能顯著降低實(shí)驗(yàn)大鼠血清TC、TG、ALT、AST的含量，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。其中，脂脈寧高劑量組改善優(yōu)于東寶肝泰對(duì)照組（P＜0.05或0.01）。

表1 各組大鼠血清TG、TC、AST、ALT水平比較

表1 各組大鼠血清TG、TC、AST、ALT水平比較

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜ 0.01；與東寶肝泰對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

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3.3 各組大鼠血清和肝組織SOD活性和MDA含量比較 見(jiàn)表2。與正常組比較，模型組大鼠血清、肝組織中SOD活性均較正常組明顯降低（P＜0.05）、MDA含量均較正常組升高（P＜0.05或0.01）。各治療組大鼠血清、肝組織中SOD活性均高于模型組、MDA含量均低于模型組（P＜0.05或0.01）。脂脈寧高、低劑量組血清、肝組織中SOD含量均高于東寶肝泰對(duì)照組，MDA含量均低于東寶肝泰對(duì)照組（P＜0.05或0.01）。

表2 各組大鼠血清和肝組織SOD活性和MDA含量的比較

表2 各組大鼠血清和肝組織SOD活性和MDA含量的比較

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4 討 論

AFL在中醫(yī)學(xué)中無(wú)獨(dú)立的病名，根據(jù)其病因、病機(jī)及臨床表現(xiàn)，可歸屬于中醫(yī)學(xué) “酒疸”、“脅痛”、“傷酒”、“酒癖”、“酒脹”、“酒勞”、“積聚”等范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為酒為濕熱有毒之邪氣，味甘，苦辛，性溫，有毒；入心、肝、脾、胃經(jīng)。過(guò)量飲用則酒毒濕熱蘊(yùn)結(jié)于中焦，損傷脾胃，濕濁內(nèi)生，聚濕生痰，痰阻氣滯，肝失疏泄，氣滯血瘀，痰濕瘀毒相搏，結(jié)于脅下而成此病。病情纏綿不愈，日久則耗傷肝腎之陰。因此濕熱痰瘀互結(jié)，肝脾失調(diào)為AFL的主要病機(jī)，故脂脈寧選用澤瀉利濕消痰、泄熱；皂角刺祛痰散結(jié)；姜黃、山楂疏肝行氣、祛瘀通絡(luò)；石菖蒲、白術(shù)祛濕健脾；大黃通腑導(dǎo)滯，排除濕毒瘀積；何首烏補(bǔ)肝腎、益精血。諸藥合用，共奏祛濕泄熱、疏肝活血、健脾益腎之功。

SOD能夠清除氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞，間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力；MDA是氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸形成脂質(zhì)過(guò)氧化物的一種，其量的變化常常反映體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，也間接地反映了細(xì)胞損傷的程度。這兩個(gè)指標(biāo)反映了體內(nèi)自由基的氧化和抗自由基的水平。關(guān)于AFL的發(fā)病機(jī)理目前尚不清楚，近年來(lái)有人提出以氧應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化為中心的“二次打擊”假說(shuō)［2］，國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為細(xì)胞色素P450ⅡE1（CYP2E1）在酒精代謝過(guò)程中產(chǎn)生的氧自由基是造成AFL肝損傷的重要環(huán)節(jié)［5］。研究發(fā)現(xiàn)AFL肝臟中抗氧化物質(zhì)明顯減少，氧自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量明顯增高，自由基可與生物膜的含3個(gè)或3個(gè)以上雙鍵的脂肪酰脂質(zhì)發(fā)生加氧反應(yīng)產(chǎn)生MDA；MDA的兩個(gè)功能基又可與線(xiàn)粒體的膜質(zhì)、膜蛋白NH2交聯(lián)形成西夫氏堿增加了膜的剛性，影響線(xiàn)粒體膜中酶的活性，導(dǎo)致線(xiàn)粒體功能異常，干擾脂肪酸β氧化，ATP生成減少，導(dǎo)致脂肪在肝臟沉積［6］。因此抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)細(xì)胞膜穩(wěn)定性，減少脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的形成將有助于改善酒精性肝病肝臟損傷。

本研究顯示，模型組大鼠血清中 TC、TG、AST、ALT、MDA 和肝組織中MDA的含量明顯升高，血清和肝組織中SOD含量明顯降低，鏡下可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞索紊亂，肝細(xì)胞呈大泡樣脂肪變性，可見(jiàn)壞死灶和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。經(jīng)過(guò)藥物治療后，血清中TC、TG、AST、ALT、MDA和肝組織中MDA的含量明顯降低，血清和肝組織中SOD含量明顯升高，肝臟組織結(jié)構(gòu)明顯改善。提示脂脈寧通過(guò)增強(qiáng)肝臟抗氧化能力，清除自由基，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，以達(dá)到抗AFL的作用。此可能是脂脈寧治療AFL的作用機(jī)制之一。

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