李 檀 金星光 王 玨 黃 寓 韓 冰
侯慶華2 鄭 權(quán)2 張家策2 池明宇1
1遼寧省血栓病中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)療中心 (遼寧沈陽110101)
2遼寧省沈陽市血栓病研究所 (遼寧沈陽110101)
缺血性卒中發(fā)病率、致殘率和死亡率均較高,是威脅人類健康的重大疾病。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)和骨髓單個核細(xì)胞(BMNC)通過分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTF)、多向組織分化和調(diào)節(jié)免疫等機制,促進損傷、衰老器官的結(jié)構(gòu)及功能修復(fù),成為治療缺血性卒中理想的種子細(xì)胞。本實驗采用中藥復(fù)方聯(lián)合BMSC或BMNC蛛網(wǎng)膜下腔移植的方法治療缺血再灌注腦損傷大鼠,應(yīng)用定量ELISA方法檢測和比較大腦中動脈梗死模型(MCAO)大鼠腦組織中NGF含量的變化,分析BMSC和BMNC經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔移植,以及中藥聯(lián)合兩種細(xì)胞移植治療缺血性卒中的生物學(xué)機制。
1.1 材料 (1)實驗動物:SPF/VAF級健康雄性wistar大鼠140只 (北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司),3-4月齡、體質(zhì)量(280±20)g。 主要試劑:培養(yǎng)基 L一 DMEM(美國 GIBCO公司);胎牛血清(美國GIBCO公司);0.25%胰酶(美國GIBCO公司);大鼠淋巴細(xì)胞分離液 (天津血液研究所);ELISA試劑盒 (美國ADL公司);蝮龍抗栓丸(遼寧省血栓病中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)療中心提供,主要成分為天麻、菖蒲、黃芪、丹參、川芎、蝮蛇等,臨用時配成每毫升含生藥0.07875g的懸濁液)。主要設(shè)備:550微孔板酶標(biāo)儀(美國Bio-rad公司);MK2型洗板機(芬蘭雷勃公司);移液器(德國Eppendorf公司);倒置顯微鏡(日本 Olympus公司);303-3CO2培養(yǎng)箱 (上海陽光實驗儀器有限公司);DY89-11電動勻漿機(寧波新芝生物科技股份有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 動物分組與干預(yù) 3-4月齡雄性Wistar大鼠140只,按隨機數(shù)字法分為7組:正常組、假手術(shù)組、模型組、BMNC組、中藥聯(lián)合BMNC組、BMSC組、中藥聯(lián)合BMSC組,每組20只。因手術(shù)意外等原因,最終納入112只,平均每組16只。術(shù)后24h進行蛛網(wǎng)膜下腔細(xì)胞移植,同時予蝮龍抗栓丸灌胃(劑量為3mL/只),每日1次,4d、28d取大鼠損傷側(cè)腦組織。
1.2.2 細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和移植 密度梯度離心法分離BMNCs:3-4周齡雄性Wistar大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉,無菌條件下取出雙側(cè)股骨、脛骨。剪掉兩端,PBS反復(fù)沖洗骨髓腔。將沖洗液置于percoll分離液上離心,收集中間單層細(xì)胞,洗滌待用。BMSCs的純化和培養(yǎng):用含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基,37℃、5%CO2、飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)。24h后換新培養(yǎng)液,去除未貼壁細(xì)胞,以后每3天換液1次。鏡下細(xì)胞生長融合達(dá)80%~90%時,用0.25%胰蛋白酶消化待用。
1.2.3 動物模型制備 按Zea Longa[1]改良線栓法建立大鼠大腦中動脈栓塞2h再灌注模型(middle cerebral arterial occlusion,MCAO):3-4月齡雄性Wistar大鼠,10%水合氯醛腹腔麻醉。分離暴露右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈(ICA),結(jié)扎CCA,在根部結(jié)扎ECA,在CCA近頸內(nèi)、頸外分叉處剪一小口,將末端燒成圓頭的4cm的尼龍線順勢緩慢送入ICA,深度約為(18±2)mm,結(jié)扎ICA,在MCA起始端堵塞MCA血流。血流阻閉120min后,抽出尼龍線,回復(fù)灌注。麻醉蘇醒后,NSS評分在6-12分的大鼠為造模成功。假手術(shù)組大鼠操作至暴露ICA、ECA,正常組大鼠不做處理。
1.2.4 蛛網(wǎng)膜下腔移植BMSC 將原代培養(yǎng)的BMSCs或直接分離獲得的BMNCs制成單細(xì)胞懸液,進行蛛網(wǎng)膜下腔穿刺注射,移植細(xì)胞總數(shù)為2×107個,體積為100μL。模型組以0.01M PBS液代替。移植方法:MCAO模型大鼠造模24h后,異丙酚尾靜脈注射麻醉,于枕骨大孔處用細(xì)針頭穿刺,將細(xì)胞以1μL/min進行蛛網(wǎng)膜下腔注射。
1.3 觀察方法 定量ELISA法檢測受損腦組織內(nèi)NGF含量:水合氯醛麻醉下,手術(shù)取出MCAO大鼠右后側(cè)腦組織,進行適當(dāng)稀釋和勻漿。美國ADL.inc.NGF定量ELISA檢測試劑盒,濃度單位1.0pg/mL,檢測步驟均參照試劑盒測試步驟進行。最終反應(yīng)在微板酶標(biāo)測定儀于波長450nm處讀取OD值。所測值按標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成NGF濃度。
1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用PEMS 3.1統(tǒng)計軟件。計量資料以表示 ,采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
以標(biāo)準(zhǔn)品的平均光密度值為Y軸,對應(yīng)濃度為X軸繪得標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=0.046Ln(x)-0.1374,R2=0.915,計算腦組織中 NGF 的含量,見表1。(1)治療干預(yù)后4d,模型組腦組織內(nèi)NGF含量與正常組、假手術(shù)組、BMNC組和BMSC組接近(P>0.05);與模型組比較,中藥聯(lián)合BMNC組及中藥聯(lián)合BMSC組腦組織內(nèi)NGF含量升高(P<0.05);BMSC組腦組織內(nèi)NGF含量與BMNC組接近(P>0.05),中藥聯(lián)合BMNC組和中藥聯(lián)合BMSC組腦組織內(nèi)NGF含量較BMNC組升高(P<0.05);與BMSC組比較,中藥聯(lián)合BMNC組和中藥聯(lián)合BMSC組腦組織內(nèi)NGF含量升高 (P<0.05);中藥聯(lián)合BMNC組與中藥聯(lián)合BMSC組腦組織內(nèi)NGF含量接近(P>0.05)。(2)治療干預(yù)后28d,模型組腦組織內(nèi)NGF含量與正常組和假手術(shù)組接近(P>0.05);與模型組比較,BMNC組、BMSC組、中藥聯(lián)合BMNC組和中藥聯(lián)合 BMSC組腦組織內(nèi) NGF含量升高 (P<0.05);與BMNC組比較,BMSC組、中藥聯(lián)合BMNC組和中藥聯(lián)合BMSC組腦組織內(nèi)NGF含量升高(P<0.05);與BMSC組比較,中藥聯(lián)合BMNC組和中藥聯(lián)合BMSC組腦組織內(nèi)NGF含量升高 (P<0.05);中藥聯(lián)合BMSC組與中藥聯(lián)合BMNC組腦組織內(nèi)NGF含量接近 (P>0.05)。與本組治療后4d相比,各組腦組織內(nèi)NGF含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
表1 各組大鼠治療干預(yù)后4d、28d腦組織中NGF含量比較(pg/mL
表1 各組大鼠治療干預(yù)后4d、28d腦組織中NGF含量比較(pg/mL
與模型組比較,*P<0.05 ;與BMNC組比較,△P<0.05;與 BMSC組比較,▲P<0.05。
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近年來,應(yīng)用BMSC和BMNC治療缺血性腦卒中的研究報道較多,但中藥復(fù)方與BMSC、BMNC聯(lián)合治療的報道較少,尤其是應(yīng)用蛛網(wǎng)膜下腔注射方式進行干細(xì)胞移植的實驗研究國內(nèi)罕見報道。本研究聯(lián)合了蝮龍抗栓丸和蛛網(wǎng)膜下腔移植同種異體BMSCSBMNCS到卒中大鼠腦內(nèi),進行腦組織中NGF因子含量的定量研究,進而嘗試一種新的移植方式和移植效率的檢測手段,比較BMSC和BMNC、以及中藥與BMSC、BMNC聯(lián)合移植對卒中大鼠腦內(nèi)NGF含量的影響。
3.1 細(xì)胞移植途徑 干細(xì)胞經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔移植在實驗研究方面報道較少,也尚無大規(guī)模臨床試驗報道。本研究采用此種方式進行細(xì)胞移植,結(jié)果證明在動物模型上安全、有效。移植細(xì)胞直接進入腦脊液,廣泛地參加腦卒中后組織代謝、替代與修復(fù),不通過血管運送,無血腦屏障阻礙,最終進入腦內(nèi),歸巢到靶部位。移植創(chuàng)傷性較腦立體定位小,手術(shù)難度和風(fēng)險較腦外立體定位和高選介入移植低,移植體積劑量和細(xì)胞數(shù)量較立體定位大,分布較廣泛,并且因無血腦屏障阻礙進入腦內(nèi)的有效細(xì)胞數(shù)量較經(jīng)血管移植多,費用較介入移植、腦外立體定位移植低。但是大鼠動物實驗中移植難度較大,應(yīng)嚴(yán)格掌握進針角度、劑量、速度與移植時機,防止動物顱內(nèi)高壓死亡。
3.2 BMSC和BMNC治療腦血管病的機制及其對腦內(nèi)NGF的影響 骨髓源干細(xì)胞種類較多。BMSC是骨髓內(nèi)非造血組織干細(xì)胞,尚未發(fā)現(xiàn)特異性抗原標(biāo)記,在體內(nèi)外可向骨、肌肉、肝臟、上皮、神經(jīng)等多胚層分化[2-4]。BMNC是由骨髓提取的干/祖細(xì)胞混合群,含有如內(nèi)皮祖細(xì)胞、造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、造血內(nèi)皮母細(xì)胞等。由于細(xì)胞種類較多,移植后可多向分化。兩種細(xì)胞通過神經(jīng)組織再生、分泌NTF[5]、促進血管新生、刺激內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增值分化、抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)等機制全面修復(fù)病變組織,治療腦血管病,成為臨床治療和研究缺血性血管病的熱點。
NGF是NTF中最早被發(fā)現(xiàn)的,廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。NGF具有神經(jīng)營養(yǎng)、神經(jīng)保護和促神經(jīng)生長的生物學(xué)效應(yīng),對中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長、再生和功能特性的表達(dá)均具有重要的調(diào)控作用。腦缺血再灌注損傷后大鼠腦組織NGF水平變化不大,提示實驗大鼠對缺血再灌注神經(jīng)損傷的自我修復(fù)能力有限。在移植早期(4d),單純BMNC/BMSC移植對NTF的影響不大;28d時,兩者均能上調(diào)NGF水平,且以BMSC能力更強。
3.3 中藥與干細(xì)胞移植聯(lián)合應(yīng)用的意義 腦梗死屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇,其病機復(fù)雜,以氣虛血瘀、風(fēng)火夾痰濁、夾血瘀痹阻脈絡(luò)為主要病機。蝮龍抗栓丸以益氣活血、息風(fēng)化痰、化瘀通絡(luò)為治,對腦缺血損傷發(fā)揮治療作用。中藥復(fù)方聯(lián)合干細(xì)胞移植對腦內(nèi)細(xì)胞因子代謝方面的研究少見,本實驗應(yīng)用蝮龍抗栓丸聯(lián)合骨髓源干細(xì)胞對MCAO大鼠腦內(nèi)NGF水平進行了研究。結(jié)果顯示,在移植早期,BMNC/BMSC尚未發(fā)揮作用時,蝮龍抗栓丸的聯(lián)合使用即可上調(diào)腦內(nèi)NGF水平,較BMNC組提高了74.50%、較BMSC組提高了113.10%。至后期仍較單純BMNC/BMSC移植水平高,體現(xiàn)出蝮龍抗栓丸對BMNC/BMSC移植的彌補和協(xié)同作用。蝮龍抗栓丸與兩種細(xì)胞配合在上調(diào)NGF方面無時間和效率方面的差異。
總之,經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔移植BMNC或BMSC在晚期能夠上調(diào)MCAO大鼠腦組織內(nèi)NGF水平,中藥蝮龍抗栓丸的聯(lián)合應(yīng)用可使NGF含量進一步提高,且時間提前,濃度更高,效果平穩(wěn)而持久,彌補BMNC/BMSC移植不足的同時,又具有明顯的協(xié)同作用,更有利于受損神經(jīng)組織的保護、再生和修復(fù)以及殘障神經(jīng)功能的改善。
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