李 檀 金星光 王 玨 黃 寓 韓 冰

侯慶華2 鄭 權(quán)2 張家策2 池明宇1

1遼寧省血栓病中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)療中心 （遼寧沈陽110101）

2遼寧省沈陽市血栓病研究所 （遼寧沈陽110101）

缺血性卒中發(fā)病率、致殘率和死亡率均較高，是威脅人類健康的重大疾病。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）和骨髓單個(gè)核細(xì)胞（BMNC）通過分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子（NTF）、多向組織分化和調(diào)節(jié)免疫等機(jī)制，促進(jìn)損傷、衰老器官的結(jié)構(gòu)及功能修復(fù)，成為治療缺血性卒中理想的種子細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)采用中藥復(fù)方聯(lián)合BMSC或BMNC蛛網(wǎng)膜下腔移植的方法治療缺血再灌注腦損傷大鼠，應(yīng)用定量ELISA方法檢測和比較大腦中動(dòng)脈梗死模型（MCAO）大鼠腦組織中NGF含量的變化，分析BMSC和BMNC經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔移植，以及中藥聯(lián)合兩種細(xì)胞移植治療缺血性卒中的生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF/VAF級(jí)健康雄性wistar大鼠140只 （北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司），3-4月齡、體質(zhì)量（280±20）g。 主要試劑：培養(yǎng)基 L一 DMEM（美國 GIBCO公司）；胎牛血清（美國GIBCO公司）；0.25%胰酶（美國GIBCO公司）；大鼠淋巴細(xì)胞分離液 （天津血液研究所）；ELISA試劑盒 （美國ADL公司）；蝮龍抗栓丸（遼寧省血栓病中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)療中心提供，主要成分為天麻、菖蒲、黃芪、丹參、川芎、蝮蛇等，臨用時(shí)配成每毫升含生藥0.07875g的懸濁液）。主要設(shè)備：550微孔板酶標(biāo)儀（美國Bio-rad公司）；MK2型洗板機(jī)（芬蘭雷勃公司）；移液器（德國Eppendorf公司）；倒置顯微鏡（日本 Olympus公司）；303-3CO2培養(yǎng)箱 （上海陽光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；DY89-11電動(dòng)勻漿機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與干預(yù) 3-4月齡雄性Wistar大鼠140只，按隨機(jī)數(shù)字法分為7組：正常組、假手術(shù)組、模型組、BMNC組、中藥聯(lián)合BMNC組、BMSC組、中藥聯(lián)合BMSC組，每組20只。因手術(shù)意外等原因，最終納入112只，平均每組16只。術(shù)后24h進(jìn)行蛛網(wǎng)膜下腔細(xì)胞移植，同時(shí)予蝮龍抗栓丸灌胃（劑量為3mL/只），每日1次，4d、28d取大鼠損傷側(cè)腦組織。

1.2.2 細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和移植 密度梯度離心法分離BMNCs：3-4周齡雄性Wistar大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉，無菌條件下取出雙側(cè)股骨、脛骨。剪掉兩端，PBS反復(fù)沖洗骨髓腔。將沖洗液置于percoll分離液上離心，收集中間單層細(xì)胞，洗滌待用。BMSCs的純化和培養(yǎng)：用含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2、飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)。24h后換新培養(yǎng)液，去除未貼壁細(xì)胞，以后每3天換液1次。鏡下細(xì)胞生長融合達(dá)80%～90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化待用。

1.2.3 動(dòng)物模型制備 按Zea Longa［1］改良線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞2h再灌注模型（middle cerebral arterial occlusion,MCAO）：3-4月齡雄性Wistar大鼠，10%水合氯醛腹腔麻醉。分離暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），結(jié)扎CCA，在根部結(jié)扎ECA，在CCA近頸內(nèi)、頸外分叉處剪一小口，將末端燒成圓頭的4cm的尼龍線順勢緩慢送入ICA，深度約為（18±2）mm，結(jié)扎ICA，在MCA起始端堵塞MCA血流。血流阻閉120min后，抽出尼龍線，回復(fù)灌注。麻醉蘇醒后，NSS評分在6-12分的大鼠為造模成功。假手術(shù)組大鼠操作至暴露ICA、ECA，正常組大鼠不做處理。

1.2.4 蛛網(wǎng)膜下腔移植BMSC 將原代培養(yǎng)的BMSCs或直接分離獲得的BMNCs制成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行蛛網(wǎng)膜下腔穿刺注射，移植細(xì)胞總數(shù)為2×107個(gè)，體積為100μL。模型組以0.01M PBS液代替。移植方法：MCAO模型大鼠造模24h后，異丙酚尾靜脈注射麻醉，于枕骨大孔處用細(xì)針頭穿刺，將細(xì)胞以1μL/min進(jìn)行蛛網(wǎng)膜下腔注射。

1.3 觀察方法 定量ELISA法檢測受損腦組織內(nèi)NGF含量：水合氯醛麻醉下，手術(shù)取出MCAO大鼠右后側(cè)腦組織，進(jìn)行適當(dāng)稀釋和勻漿。美國ADL.inc.NGF定量ELISA檢測試劑盒，濃度單位1.0pg/mL，檢測步驟均參照試劑盒測試步驟進(jìn)行。最終反應(yīng)在微板酶標(biāo)測定儀于波長450nm處讀取OD值。所測值按標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成NGF濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用PEMS 3.1統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示 ，采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

以標(biāo)準(zhǔn)品的平均光密度值為Y軸,對應(yīng)濃度為X軸繪得標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.046Ln（x）-0.1374，R2=0.915,計(jì)算腦組織中 NGF 的含量，見表1。（1）治療干預(yù)后4d,模型組腦組織內(nèi)NGF含量與正常組、假手術(shù)組、BMNC組和BMSC組接近（P＞0.05）；與模型組比較，中藥聯(lián)合BMNC組及中藥聯(lián)合BMSC組腦組織內(nèi)NGF含量升高（P＜0.05）；BMSC組腦組織內(nèi)NGF含量與BMNC組接近（P＞0.05），中藥聯(lián)合BMNC組和中藥聯(lián)合BMSC組腦組織內(nèi)NGF含量較BMNC組升高（P＜0.05）；與BMSC組比較，中藥聯(lián)合BMNC組和中藥聯(lián)合BMSC組腦組織內(nèi)NGF含量升高 （P＜0.05）；中藥聯(lián)合BMNC組與中藥聯(lián)合BMSC組腦組織內(nèi)NGF含量接近（P＞0.05）。（2）治療干預(yù)后28d,模型組腦組織內(nèi)NGF含量與正常組和假手術(shù)組接近（P＞0.05）；與模型組比較，BMNC組、BMSC組、中藥聯(lián)合BMNC組和中藥聯(lián)合 BMSC組腦組織內(nèi) NGF含量升高 （P＜0.05）；與BMNC組比較，BMSC組、中藥聯(lián)合BMNC組和中藥聯(lián)合BMSC組腦組織內(nèi)NGF含量升高（P＜0.05）；與BMSC組比較，中藥聯(lián)合BMNC組和中藥聯(lián)合BMSC組腦組織內(nèi)NGF含量升高 （P＜0.05）；中藥聯(lián)合BMSC組與中藥聯(lián)合BMNC組腦組織內(nèi)NGF含量接近 （P＞0.05）。與本組治療后4d相比，各組腦組織內(nèi)NGF含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組大鼠治療干預(yù)后4d、28d腦組織中NGF含量比較（pg/mL

表1 各組大鼠治療干預(yù)后4d、28d腦組織中NGF含量比較（pg/mL

與模型組比較，*P＜0.05 ；與BMNC組比較，△P＜0.05；與 BMSC組比較，▲P＜0.05。

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3 討論

近年來，應(yīng)用BMSC和BMNC治療缺血性腦卒中的研究報(bào)道較多，但中藥復(fù)方與BMSC、BMNC聯(lián)合治療的報(bào)道較少，尤其是應(yīng)用蛛網(wǎng)膜下腔注射方式進(jìn)行干細(xì)胞移植的實(shí)驗(yàn)研究國內(nèi)罕見報(bào)道。本研究聯(lián)合了蝮龍抗栓丸和蛛網(wǎng)膜下腔移植同種異體BMSCSBMNCS到卒中大鼠腦內(nèi),進(jìn)行腦組織中NGF因子含量的定量研究，進(jìn)而嘗試一種新的移植方式和移植效率的檢測手段，比較BMSC和BMNC、以及中藥與BMSC、BMNC聯(lián)合移植對卒中大鼠腦內(nèi)NGF含量的影響。

3.1 細(xì)胞移植途徑 干細(xì)胞經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔移植在實(shí)驗(yàn)研究方面報(bào)道較少，也尚無大規(guī)模臨床試驗(yàn)報(bào)道。本研究采用此種方式進(jìn)行細(xì)胞移植，結(jié)果證明在動(dòng)物模型上安全、有效。移植細(xì)胞直接進(jìn)入腦脊液，廣泛地參加腦卒中后組織代謝、替代與修復(fù)，不通過血管運(yùn)送，無血腦屏障阻礙，最終進(jìn)入腦內(nèi)，歸巢到靶部位。移植創(chuàng)傷性較腦立體定位小，手術(shù)難度和風(fēng)險(xiǎn)較腦外立體定位和高選介入移植低，移植體積劑量和細(xì)胞數(shù)量較立體定位大，分布較廣泛，并且因無血腦屏障阻礙進(jìn)入腦內(nèi)的有效細(xì)胞數(shù)量較經(jīng)血管移植多，費(fèi)用較介入移植、腦外立體定位移植低。但是大鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中移植難度較大，應(yīng)嚴(yán)格掌握進(jìn)針角度、劑量、速度與移植時(shí)機(jī)，防止動(dòng)物顱內(nèi)高壓死亡。

3.2 BMSC和BMNC治療腦血管病的機(jī)制及其對腦內(nèi)NGF的影響 骨髓源干細(xì)胞種類較多。BMSC是骨髓內(nèi)非造血組織干細(xì)胞，尚未發(fā)現(xiàn)特異性抗原標(biāo)記，在體內(nèi)外可向骨、肌肉、肝臟、上皮、神經(jīng)等多胚層分化［2-4］。BMNC是由骨髓提取的干/祖細(xì)胞混合群,含有如內(nèi)皮祖細(xì)胞、造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、造血內(nèi)皮母細(xì)胞等。由于細(xì)胞種類較多，移植后可多向分化。兩種細(xì)胞通過神經(jīng)組織再生、分泌NTF［5］、促進(jìn)血管新生、刺激內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增值分化、抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)等機(jī)制全面修復(fù)病變組織，治療腦血管病，成為臨床治療和研究缺血性血管病的熱點(diǎn)。

NGF是NTF中最早被發(fā)現(xiàn)的，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。NGF具有神經(jīng)營養(yǎng)、神經(jīng)保護(hù)和促神經(jīng)生長的生物學(xué)效應(yīng)，對中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長、再生和功能特性的表達(dá)均具有重要的調(diào)控作用。腦缺血再灌注損傷后大鼠腦組織NGF水平變化不大，提示實(shí)驗(yàn)大鼠對缺血再灌注神經(jīng)損傷的自我修復(fù)能力有限。在移植早期（4d），單純BMNC/BMSC移植對NTF的影響不大；28d時(shí)，兩者均能上調(diào)NGF水平，且以BMSC能力更強(qiáng)。

3.3 中藥與干細(xì)胞移植聯(lián)合應(yīng)用的意義 腦梗死屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，其病機(jī)復(fù)雜，以氣虛血瘀、風(fēng)火夾痰濁、夾血瘀痹阻脈絡(luò)為主要病機(jī)。蝮龍抗栓丸以益氣活血、息風(fēng)化痰、化瘀通絡(luò)為治，對腦缺血損傷發(fā)揮治療作用。中藥復(fù)方聯(lián)合干細(xì)胞移植對腦內(nèi)細(xì)胞因子代謝方面的研究少見，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用蝮龍抗栓丸聯(lián)合骨髓源干細(xì)胞對MCAO大鼠腦內(nèi)NGF水平進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，在移植早期，BMNC/BMSC尚未發(fā)揮作用時(shí)，蝮龍抗栓丸的聯(lián)合使用即可上調(diào)腦內(nèi)NGF水平，較BMNC組提高了74.50%、較BMSC組提高了113.10%。至后期仍較單純BMNC/BMSC移植水平高，體現(xiàn)出蝮龍抗栓丸對BMNC/BMSC移植的彌補(bǔ)和協(xié)同作用。蝮龍抗栓丸與兩種細(xì)胞配合在上調(diào)NGF方面無時(shí)間和效率方面的差異。

總之,經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔移植BMNC或BMSC在晚期能夠上調(diào)MCAO大鼠腦組織內(nèi)NGF水平,中藥蝮龍抗栓丸的聯(lián)合應(yīng)用可使NGF含量進(jìn)一步提高，且時(shí)間提前，濃度更高，效果平穩(wěn)而持久，彌補(bǔ)BMNC/BMSC移植不足的同時(shí)，又具有明顯的協(xié)同作用，更有利于受損神經(jīng)組織的保護(hù)、再生和修復(fù)以及殘障神經(jīng)功能的改善。

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