李棟才，邱書奇，趙海亮，楊 貴，姚春燕

(深圳市龍崗中心醫(yī)院耳鼻咽喉科醫(yī)院，深圳市耳鼻咽喉研究所，廣東深圳518172)

鼻咽癌是我國華南地區(qū)、東南亞其他國家和地中海盆地的高發(fā)性惡性腫瘤，傳統(tǒng)的放療易出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此尋找更有效的鼻咽癌治療藥物具有深遠(yuǎn)意義。隨著分子生物學(xué)各項(xiàng)技術(shù)的日趨成熟，細(xì)胞因子的治療作為腫瘤治療的一個(gè)新靶點(diǎn)，已成為腫瘤防治研究的一個(gè)活躍領(lǐng)域。白細(xì)胞介素24(interleukin 24，IL-24)作為一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，可選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而對(duì)正常細(xì)胞無影響，對(duì)鼻咽癌的治療有一定的應(yīng)用前景。本研究通過細(xì)胞計(jì)數(shù)、四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)抑制試驗(yàn)探討其對(duì)鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞株增殖的作用，為今后鼻咽癌研究和治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和研究思路。

1 資料與方法

1.1 鼻咽癌 CNE-2Z細(xì)胞株體外培養(yǎng)、細(xì)胞計(jì)數(shù) 鼻咽癌低分化細(xì)胞株CNE-2Z由廣東醫(yī)學(xué)院分子生物室保存，用含10%滅活小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。用含10%滅活胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/mL，在24孔培養(yǎng)板中加入細(xì)胞懸液 1.0 mL/孔，每孔細(xì)胞數(shù) 2 ×106，37℃、5%CO2、100%濕度培養(yǎng)72 h，臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞率＞95%。分別按IL-24 0、5、10、20、50、100 pg/L接種細(xì)胞，每個(gè)濃度重復(fù)3孔，分別于培養(yǎng) 0、12、24、36、48、60、72 h 后收集細(xì)胞，0.05%臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)不著色細(xì)胞，計(jì)算存活細(xì)胞百分率。每4天半量換液。待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期后收集細(xì)胞作MTT試驗(yàn)。

1.2 MTT比值法檢測細(xì)胞增殖抑制率 收集培養(yǎng)48 h的細(xì)胞至96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為2×105，血清濃度調(diào)整為10%，每孔體積為200 μL，每孔加 MTT 20 μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng) 4 h;然后離心吸棄上清，每孔加二甲基亞砜200 μL，微量振蕩器上振蕩10 min，待紫色結(jié)晶完全溶解后，用酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞A570/A630吸光值，以0 pg/L IL-24組為對(duì)照組，計(jì)算IL-24對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z的抑制率。抑制率=(1－用藥組A值/對(duì)照組A值)×100%，作出量效關(guān)系曲線，尋找抑制率最高的IL-24濃度，就是IL-24作用的峰濃度。以峰濃度的IL-24為實(shí)驗(yàn)組，不加IL-24為對(duì)照組，在培養(yǎng)的 12、24、36、48、60、72 h 后，用 MTT比色法檢測CNE-2Z的生長抑制率，作時(shí)效關(guān)系曲線，以了解細(xì)胞增殖狀況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較使用方差分析F檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化 鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞株在培養(yǎng)的第48 h生長狀況最差，并且隨著IL-24濃度的增加，其活細(xì)胞數(shù)也隨著減少。當(dāng)IL-24為50 pg/L時(shí)，其增殖狀況最差;當(dāng) IL-24為100 pg/L時(shí)，其增殖狀況反而好轉(zhuǎn)(表1，圖1)。

表1 鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z的增殖狀況(×104/mL)

圖1 體外培養(yǎng)的NPC細(xì)胞株CNE-2Z的增殖狀況

2.2 MTT比色法檢測 IL-24對(duì)鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞株的抑制率。

2.2.1 不同濃度IL-24培養(yǎng)48 h對(duì)鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞株增殖的影響 IL-24 濃度為 5、10、20、50、100 pg/L時(shí)，對(duì)鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞株的抑制率分別為(8.6 ±2.2)%、(14.6 ±3.1)%、(35.6 ±5.6)%、(58.0 ±6.8)%、(42.0 ±5.2)%，各時(shí)間點(diǎn)的抑制率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=221.7，P ＜0.05)。IL-24濃度在0～50 pg/L范圍內(nèi)，隨IL-24濃度增加，其對(duì)鼻咽癌 CNE-2Z細(xì)胞株的抑制作用遞增，當(dāng)IL-24＞50 pg/L其對(duì)鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞株的抑制作用有所減弱(圖2)。

圖2 不同濃度IL-24在培養(yǎng)的48 h對(duì)鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞株增殖的影響

2.2.2 IL-24濃度50 pg/L作用不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞株增殖的影響 IL-24濃度為50 pg/L作用 12、24、36、48、60、72 h，對(duì)鼻咽癌 CNE-2Z細(xì)胞株的抑制率分別為(15.0 ±1.1)%、(17.0 ±1.6)%、(35.0 ± 2.5)%、(58.0 ± 4.6)%、(48.6 ±4.2)%、(46.0 ±4.6)%，各時(shí)間點(diǎn)的抑制率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=492.9，P ＜0.05)。在 48 h內(nèi)，隨著作用時(shí)間的延長，其抑制作用遞增，當(dāng)作用時(shí)間＞48 h，其抑制作用有所減弱(圖3)。

圖3 IL-24 50 pg/L作用不同時(shí)間對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z增殖的影響

3 討論

鼻咽癌嚴(yán)重威脅人類的身體健康。世界大部分地區(qū)發(fā)病率較低，一般在1/10萬以下，其發(fā)病有著明顯的區(qū)域性和種族差異，好發(fā)于黃種人而白種人少見。盡管IL-24對(duì)乳腺癌、肝癌、直腸癌等細(xì)胞凋亡作用的研究已取得了較多的成果，但鼻咽癌作為中國南方多發(fā)的癌癥，目前有關(guān)IL-24對(duì)鼻咽癌細(xì)胞凋亡作用的研究比較少。

IL-24(mda-7黑素瘤分化相關(guān)因子)是近年來發(fā)現(xiàn)的很有應(yīng)用前景的細(xì)胞因子，IL-24是一種潛在的腫瘤抑制劑［1］。應(yīng)用外源性的IL-24可抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長，并誘導(dǎo)其凋亡，但它對(duì)正常的細(xì)胞無損害［2-4］。IL-24基因可以在過表達(dá)水平下通過各種信號(hào)通路和途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而對(duì)正常細(xì)胞沒有影響，且凋亡誘導(dǎo)作用不依賴p53、p21等抑癌基因的活性。更因?yàn)樗瑫r(shí)具有抗血管生成以及抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移的作用，使得它在體內(nèi)和臨床實(shí)驗(yàn)中也可以取得良好的實(shí)際效果［5，6］，此外，也有體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)，將Ad-mda7處理后的纖維肉瘤細(xì)胞注射入小鼠，有免疫系統(tǒng)的小鼠中腫瘤細(xì)胞無法生長，而在無免疫系統(tǒng)的小鼠中腫瘤細(xì)胞卻可以生長［7］。目前一些抗腫瘤藥物［8］和免疫調(diào)節(jié)藥物［9］已在被嘗試與mda27基因聯(lián)合使用，以探索加強(qiáng)腫瘤殺傷效果以及克服耐藥性。而更新、更有效的病毒載體的探索也在進(jìn)行中，比如用腺相關(guān)病毒1成功介導(dǎo)mda-7基因抑制腫瘤生長［10］，以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向的腺病毒載體搭載mda27基因(Ad2ER2mda7)加強(qiáng)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用［11］，這些都對(duì)如何更加有效地發(fā)揮mda27的抗腫瘤作用提供了研究思路和方向。

近來的研究表明，不需要通過腺病毒介導(dǎo)，純化的IL-24也可抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡［12，13］。國內(nèi)苑興卉等［14］以重組腺病毒作為載體通過凋亡實(shí)驗(yàn)證實(shí)了mda-7基因針對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z的凋亡誘導(dǎo)效果;但純化的IL-24對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z增殖的影響尚未見報(bào)道。應(yīng)用一定劑量外源性IL-24誘導(dǎo)其鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z凋亡而不損傷正常細(xì)胞是否能成為有效治療該病的切入點(diǎn)，尚待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用外源性的IL-24作用于鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-24可呈時(shí)間和劑量依賴性地抑制鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z增殖。應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)得出:IL-24可抑制體外培養(yǎng)的鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z的增殖，在IL-24濃度為0～50 pg/L時(shí)呈劑量依賴性。而當(dāng)IL-24濃度為100 pg/L時(shí)，其增殖狀況反而好轉(zhuǎn)，存在峰濃度效應(yīng);并且在第48小時(shí)其增殖情況最差。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用MTT比色法測定不同濃度IL-24作用后的細(xì)胞增殖受抑制的情況，得出IL-24對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z的抑制率呈明顯的峰濃度效應(yīng)。IL-24濃度為50 pg/L時(shí)，對(duì)細(xì)胞的抑制率最高，低于或高于該濃度其抑制率均有所減低。并且在48 h其抑制率最高。細(xì)胞因子在刺激或抑制細(xì)胞增殖過程中，均存在峰值濃度，低于或高于峰值濃度，效果反而下降，峰濃度為最大效應(yīng)濃度。IL-24作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)都是通過與受體結(jié)合來實(shí)現(xiàn)，與受體結(jié)合可以使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物3和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物1發(fā)生磷酸化作用，同時(shí)向細(xì)胞核移動(dòng)［13］。所以IL-24的峰濃度效應(yīng)可能與受體飽和等因素有關(guān)，IL-24(50 pg/L)并不能完全抑制體外培養(yǎng)的鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z的增殖，可能與鼻咽癌的病因、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜有關(guān)。Yang等［15］報(bào)道，IL-24濃度為50 pg/L時(shí)，可明顯抑制A549細(xì)胞增殖，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。Cheng等［16］報(bào)道，IL-24可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的急性白血病核細(xì)胞凋亡，在培養(yǎng)的48 h，可見到DNA出現(xiàn)梯形條帶，該時(shí)間窗與本實(shí)驗(yàn)相似，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探索。本實(shí)驗(yàn)為今后鼻咽癌研究和治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和研究思路。

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