楊 柳 付永鋒 李雪萍 馮 萌 程訓佳 （復旦大學上海醫(yī)學院病原生物學系,上海 200032）

多主枝孢霉重組變應(yīng)原Cla h8的制備及其免疫活性鑒定①

楊 柳 付永鋒 李雪萍 馮 萌 程訓佳 （復旦大學上海醫(yī)學院病原生物學系,上海 200032）

目的:通過基因工程手段,獲得重組多主枝孢霉變應(yīng)原蛋白Cla h8,有利于進行變應(yīng)原的標準化,為標準化抗原的臨床特異性診斷與治療奠定基礎(chǔ)。方法:從多主枝孢霉菌體中提取總RNA,采用RT-PCR的方法擴增Cla h8編碼基因,將其連入pET-19b載體。轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21 Star（DE3）pLysS,經(jīng)誘導表達后,進行提純復性,用Western blot和 Dot-blot檢測其免疫活性。結(jié)果:重組多主枝孢霉變應(yīng)原Clah8蛋白可以與多主枝孢霉過敏患者的血清中IgE和IgG抗體特異性結(jié)合,與天然蛋白具有相似的免疫活性。結(jié)論:制備并獲得了具有生物學活性的可溶性重組多主枝孢霉變應(yīng)原Cla h8蛋白,可用于多主枝孢霉變應(yīng)原的標準化,克服天然提取物的非單一性及標準化難的障礙。

多主枝孢霉;重組變應(yīng)原Cla h8;蛋白表達;變應(yīng)原活性

過敏性哮喘是危害嚴重的公共衛(wèi)生問題,其發(fā)病率及死亡率呈持續(xù)上升趨勢。環(huán)境中存在的各種變應(yīng)原是過敏性哮喘主要誘發(fā)原因。這些變應(yīng)原包括塵螨、動物的皮屑、花粉和霉菌等。在溫濕環(huán)境中,霉菌是引起過敏性疾病的主要誘因。在全世界,霉菌可引起5%～30%的過敏患者的IgE反應(yīng)[1]。多主枝孢霉（Cladosporiumherbarum）是引起過敏性疾病的主要霉菌之一,它不僅是一種主要的室內(nèi)過敏原,也是夏秋兩季主要的室外過敏原,可導致患者出現(xiàn)嚴重的過敏性哮喘[2]。

多主枝孢霉含有多種變應(yīng)原蛋白,現(xiàn)已被成功純化鑒定的變應(yīng)原有8種。最近,純化出Cla h8是一種NADP依賴性甘露醇脫氫酶（NADP-dependent M tDH）,可被57%左右多主枝孢霉過敏患者血清中的IgE抗體特異性識別;臨床皮膚點刺實驗結(jié)果表明Cla h8可以引起患者出現(xiàn)皮膚的紅腫,而其它7種變應(yīng)原陽性檢出率則不到22%[3]。因而,Cla h8是多主枝孢霉的主要變應(yīng)原,可作為多主枝孢霉過敏患者的診斷和免疫治療的候選分子。本研究從培養(yǎng)的多主枝孢霉獲得cla h8基因并在大腸桿菌中進行表達,純化制備出具有天然免疫活性的重組Cla h8,實現(xiàn)多主枝孢霉變應(yīng)原的標準化,為了特異性診斷與免疫治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體 多主枝孢霉（C.herbarum）（ATCC 6056）購自美國ATCC菌種庫;原核表達載體pET-19b購自美國Novagen公司;大腸桿菌JM 109感受態(tài)細胞購自大連TaKaRa公司;E.coliBL21 Star（DE3）pLysS購自美國Invitrogen公司。

1.1.2 主要實驗材料 Rneasy Total RNA kit購自德國Qiagen公司;GeneAmp RNA PCR Kit購自美國Perkin-Elmer公司;Protein refolding kit購自 Novagen公司;Taq酶和100 bp Laddermaker購自大連TaKaRa公司;引物合成和測序由上海Invitrogen公司完成;His-probe（H-3）購自美國Santa公司;鼠抗Cla h8變應(yīng)原單克隆抗體3G10和1F3由本實驗室自制保存;本研究所用患者血清由福建莆田人民醫(yī)院提供并存儲于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 多主枝孢霉的培養(yǎng) 將保存的多主枝孢霉（C.herbarum）菌株接種于100ml YPD培養(yǎng)基（10 g/L yeastextract,20 g/L peptone,20 g/L glucose,pH6.0～6.5）,25～28℃培養(yǎng)6天,離心收集菌體沉淀,PBS緩沖液洗滌菌體三次,-80℃保存?zhèn)溆肹4]。

1.2.2 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建 按照Rneasy Total RNA Kit的使用說明,提取多主枝孢霉菌體的總RNA,使用GeneAmp RNA PCRKit進行 RT-PCR,獲得cDNA。根據(jù)GeneBank公布的cla h8的mRNA序列（AY191816）設(shè)計特異性引物,并加入NdeⅠ和BamHⅠ酶切位點和保護性堿基。上游引物為 5′-CCCATATGCCTGGCCAGCAAGCAA-3′,下游 引物 為 5′-CGGGATCCTTATCTGGTGGTGTAACCA-3′。 以 cDNA為模板,PCR擴增編碼Cla h8成熟肽段的基因片段。經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物以NdeⅠ和BamHⅠ酶切后,插入pET19b載體中。轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109,將菌液涂布于LB瓊脂板（含氨芐青 50μg/ml,氯霉素34μg/m l）,37℃過夜培養(yǎng)后,提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定和測序鑒定。

1.2.3 重組多主枝孢霉變應(yīng)原Cla h8表達 重組質(zhì)粒 pET19b-Cla h8轉(zhuǎn)入E.coliBL21 Star（DE3）pLysS后,挑取單菌落入800ml LB培養(yǎng)液中（含氨芐青霉素50μg/m l,氯霉素34μg/ml）,37℃振搖培養(yǎng)至OD600約為0.5時,加終濃度為1mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside,IPTG）,37℃誘導3小時后,4℃10 000 r/min離心10分鐘,收集細菌沉淀。將沉淀超聲后取其少量,12.5%SDS-PAGE電泳,觀察結(jié)果。

1.2.4 重組多主枝孢霉變應(yīng)原Cla h8純化與復性參照Protein公司的refolding kit使用說明,細菌沉淀中,加入40 ml IB wash buffer和1 mmol/L苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF）,冰上超聲后,加入溶菌酶（終濃度為200μg/m l）混勻,30℃振搖30分鐘后,冰上超聲,10 000 r/min離心10分鐘,棄上清,反復洗滌直至沉淀的顏色一致。以12.5%的SDS-PAGE電泳檢測蛋白純度。將純化復性后的蛋白,以DC Protein Assay試劑盒測定蛋白濃度后,4℃冰箱保存。

1.2.5 免疫印跡實驗 參照Tachibana等人[5]的方法進行免疫印跡實驗。多主枝孢霉浸提液和重組Cla h8進行還原SDS-PAGE電泳后,電轉(zhuǎn)到醋酸纖維素膜上。以含5%脫脂奶的PBS于濕盒內(nèi)室溫封閉膜1小時;分別加His-probe（H-3）（1∶500稀釋）、鼠抗Cla h8抗體3G10和1F3,多主枝孢霉過敏的哮喘病人血清（1∶2稀釋）,4℃孵育過夜;分別加HRP-goat Anti-mouse抗體（1∶500稀釋）,HRP-Mouse Anti-Human IgE抗體（1∶250稀釋）,室溫孵育1小時;以Konica Immunostaining HRP-100顯色,20分鐘后終止反應(yīng),觀察結(jié)果。

1.2.6 Dot blot檢測 參照Tachibana等人的方法進行Dotblot檢測[6]。分別將多主枝孢霉浸提物2μg和重組Cla h8蛋白2μg加樣于硝酸纖維素膜上,室溫干燥后,以含3%牛血清白蛋白的PBS濕盒內(nèi)室溫封閉1小時;分別加對多主枝孢霉過敏的哮喘病人血清（1∶2稀釋和1∶100稀釋）,4℃孵育過夜;分別加HRP-Mouse Anti-Human IgE抗體（1∶250稀釋）和HRP-Mouse Anti-Human IgG 抗體（1∶250稀釋）,室溫孵育1小時;以Konica ImmunostainingHRP-100顯色,20分鐘后終止反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR反應(yīng)擴增Cla h8基因 用RNA提取試劑盒提取多主枝孢霉的總RNA,用引物通過RTPCR反應(yīng)擴增出Cla h8蛋白編碼基因,PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果顯示在800 bp左右處有明顯條帶,大小與理論值（804 bp）相符（圖1）。

2.2 重組表達載體的構(gòu)建與序列分析 表達載體pET19b-Cla h8經(jīng)NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切,電泳結(jié)果表明目標條帶與clah8基因片段的PCR產(chǎn)物大小一致,說明成功構(gòu)建了多主枝孢霉變應(yīng)原Cla h8的重組質(zhì)粒pET19b-Cla h8（圖2）。對cla h8基因片段進行測序鑒定,并將該序列在GeneBank中進行注冊（HQ317138）。與GeneBank中公布的序列（AY191816）進行比對,結(jié)果表明cla h8基因片段編碼的氨基酸序列缺少C末端非編碼區(qū)（由63個核苷酸組成）,并有9個核苷酸位點與AY191816不同,但未引起氨基酸殘基的改變。

2.3 重組蛋白Clah8的表達 以重組質(zhì)粒pET19b-Cla h8轉(zhuǎn)入 E.coli BL21 Star（DE3）pLysS,挑取轉(zhuǎn)化子培養(yǎng),進行誘導表達,菌體經(jīng)超聲破碎后,進行SDS-PAGE分析,結(jié)果顯示在M r約為33 kD處有明顯條帶。超聲破碎的上清中無目的蛋白,表達蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀中（圖3A）。

圖1 cla h8基因RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.1 Argarose gel electrophoresis analysis of RT-PCR p roduction of cla h8 gene

圖2 重組表達載體pET19b-Cla h8的雙酶切鑒定Fig.2 Doub le enzyme cutting result

2.4 重組蛋白Cla h8的純化和復性 將包涵體反復洗滌以去除外膜蛋白,直至沉淀顏色一致,SDSPAGE電泳分析,可見較高純度的包涵體（圖3B）。經(jīng)復性重構(gòu)后,用SDS-PAGE電泳分析,結(jié)果顯示目的蛋白純度可達98%以上（圖3C）。DCProtein Assay試劑盒測定所得純化蛋白的濃度,最終結(jié)果表明每升培養(yǎng)液能夠得到純化重組蛋白22.5mg。

2.5 Western blot分析 經(jīng)過還原條件SDS-PAGE轉(zhuǎn)膜后,用本實驗室篩選出的重組Cla h8的單抗細胞株3G10和1F3分別作用于重組蛋白和天然蛋白,重組蛋白在33 kD處有明顯條帶,天然蛋白在31 kD處有明顯條帶（圖4）。多主枝孢霉過敏病人血清中的IgE抗體可與重組Cla h8蛋白特異性結(jié)合,其中2號病人反應(yīng)性最強（圖5）。

圖3 重組蛋白Cla h8的SDS-PAGE分析圖Fig.3 SDS-PAGE analysis of the recombinant Cla h8 protein

圖4 單克隆抗體與多主枝孢霉變應(yīng)原的反應(yīng)性Fig.4 Responses of the monoclonal antibodies to Cladosporium herbarum allergen

圖5 目的蛋白 Cla h8的Western blot鑒定Fig.5 Western b lot analysis of Cla h8 p rotein

圖6 目的蛋白 Cla h8的Dot blot鑒定Fig.6 Dot blotanalysis of Cla h8 p rotein

2.6 Dot blot檢測 多主枝孢霉浸提物和重組Cla h8蛋白均可與多主枝孢霉過敏的哮喘病人血清中的IgE和IgG發(fā)生特異性結(jié)合。重組Cla h8蛋白與病人血清中的IgE和IgG抗體的反應(yīng)性要強于多主枝孢霉的浸提液（圖6）。

3 討論

變應(yīng)原可引起不同程度的過敏性疾病,以哮喘最為常見。全世界現(xiàn)有3億的哮喘患者,其中50%以上的成人和至少80%的兒童患者均由各種環(huán)境中的變應(yīng)原誘發(fā),每年有25萬以上的患者死于哮喘。霉菌是引起變態(tài)反應(yīng)性疾病的主要原因之一,其中多主枝孢霉和鏈隔孢霉是主要的致敏真菌。在美國波特蘭市,30%的哮喘患者與對多主枝孢霉過敏有關(guān)[7]。因此,真菌變應(yīng)原對于變態(tài)反應(yīng)性疾病的診斷與治療具有重要意義,但由于真菌變應(yīng)原蛋白的組分受多種因素影響,以及天然真菌提取液中變應(yīng)原種類繁多,造成制備標準化制劑的難度極大,故限制了它在臨床上的應(yīng)用[8]。

多主枝孢霉變應(yīng)原Clah8是一種NADP依賴性甘露醇脫氫酶（NADP-dependentMtDH）,是多主枝孢霉的主要變應(yīng)原蛋白,可被57%左右多主枝孢霉過敏患者血清中的IgE抗體特異性識別,并且皮膚點刺實驗可引起患者出現(xiàn)皮膚的紅腫[3]。本研究中,3個對多主枝孢霉過敏的患者血清中IgG和IgE抗體都能與重組Cla h8特異性的結(jié)合,說明Cla h8作為多主枝孢霉的主要變應(yīng)原,可以作為對多主枝孢霉過敏患者的診斷和特異性免疫治療的候選分子。

利用DNA重組技術(shù)制備霉菌的主要變應(yīng)原,具有成分單一,活性穩(wěn)定,操作簡單的優(yōu)點,有利于工藝流程的標準化。pET載體系統(tǒng)是一種原核表達載體,本研究采用的是pET19b,其特點可以在重組蛋白的N末端具有10個組氨酸標簽以利于蛋白純化,因此重組Cla h8比天然蛋白分子大2 kD左右,而組氨酸標簽對重組蛋白生物學活性影響不大。由于目的蛋白在大腸桿菌BL21 Star（DE3）pLysS中高效表達,蛋白聚積形成不溶性的包涵體蛋白,為此需對包涵體蛋白進行變性重構(gòu)使其成為與天然蛋白相似的可溶性蛋白。包涵體蛋白的變性重構(gòu)的關(guān)鍵是復性后的可溶性蛋白和天然蛋白具有相同的生物活性。在還原條件下,重組Cla h8和天然蛋白都能被抗Cla h8鼠單抗和對多主枝孢霉過敏病人血清中的IgE和IgG特異性識別,說明重組變應(yīng)原與天然蛋白具有相同線性抗原表位。非還原條件下的Dot bolt也證實重組變應(yīng)原與天然蛋白具有相同抗原活性。

本研究利用DNA重組技術(shù)建立了Cla h8變應(yīng)原蛋白的制備方法,鑒定了其良好的免疫學活性。為大量制備標準化真菌變應(yīng)原診斷試劑,推進臨床應(yīng)用標準化抗原特異性免疫治療奠定了良好基礎(chǔ)。

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[收稿2010-11-27 修回2011-01-11]

（編輯 張曉舟）

Production of recombinantCladosporiumherbarumallergen Cla h8 and investigation on its immunological activities

YANGLiu,FUYong-Feng,LIXue-Ping,FENGMeng,CHENGXun-Jia.DepartmentofMedicalMicrobiologyandparasitology,ShanghaiMedicalCollegeofFudanUniversity,Shanghai200032,China

Objective:To gain large amount of recombinant allergen Cla h8 ofCladosporiumherbarumthrough genetic engineering method,which notonly facilitates the standardization of allergen vaccination,butalso ismore suitable fordiagnosis and treatment.Methods:The total RNA was acquired fromC.herbarumculture,then the clah8 gene fragments amplified by RT-PCRwas cloned into vector pET-19b and then transformed toE.coliBL21 Star（DE3）pLysS.After induction,Cla h8 was expressed as inclusion body inE.coliBL21 Star（DE3）pLysS.The solub le protein,following purification and renaturation,was obtained.The immunological activity was identified by Dot-blot and Western blot.Results:The IgE and IgG of the serum fromC.herbarumallergic patients could specially reactwith the recombinantClah8（rCla h8）,and the immunologicalactivity of rCla h8was comparablewith the native protein.Conclusion:We have successfu lly obtained the recombinantCla h8 equippedwith immunologicalactivity,which leads to significant improvements in allergy diagnosis and treatment.The approach has also resolved the problems of natural allergen extracts associated withmulti-componentand difficult standardization.

Cladosporiumherbarum;Recombinantallergen Cla h8;Protein expression;IgE

R392.8

A

1000-484X（2011）05-0446-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.05.015

①本文受國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃項目（2007AA02Z472）和衛(wèi)生行業(yè)科研專項項目（20082001）資助

楊 柳（1983年-）,女,在讀碩士,主要從事過敏性疾病診斷與防治研究;

及指導教師:程訓佳（1960年-）,女,博士,教授,博士生導師,主要從事過敏性疾病診斷、防治和醫(yī)學原蟲的致病機制與分子生物學研究,E-mail:xjcheng@shmu.edu.cn。