余紅梅 李 琪 尤列·皮爾曼 維克多·科羅索夫 周向東

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科,重慶 400010）

Elafin真核表達載體的構(gòu)建及其對氣道粘液高分泌的調(diào)節(jié)①

余紅梅 李 琪 尤列·皮爾曼②維克多·科羅索夫②周向東

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科,重慶 400010）

目的:構(gòu)建天然內(nèi)生多肽Elafin真核表達載體,探討其對氣道粘液高分泌的影響。方法:抽提Elafin行RT-PCR獲取Elafin cDNA,雙酶切后將片段裝載到pMD18-T載體上。以pMD18-T-Elafin為模板行PCR反應(yīng),產(chǎn)物膠回收并雙酶切后定向克隆至pEGFP-N1上,轉(zhuǎn)化,篩選,雙酶切鑒定重組質(zhì)粒。將pEGFP-N1-Elafin轉(zhuǎn)染正常人支氣管上皮細胞HBE16,給予脂多糖（LPS）刺激,Western blot檢測細胞內(nèi)Elafin蛋白的相對含量,RT-PCR檢測各組ElafinmRNA和粘蛋白（MUC）5ACmRNA表達水平,熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)測定核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）的活性;ELISA法分析各組細胞MUC5AC蛋白的相對含量。結(jié)果:成功構(gòu)建Elafin真核表達載體,轉(zhuǎn)染重組 Elafin的HBE16細胞成功表達Elafin蛋白。LPS刺激可增強NF-κB的活性,該活性在轉(zhuǎn)染重組Elafin后顯著降低;MUC5AC蛋白含量及mRNA水平在LPS刺激后也顯著升高,在轉(zhuǎn)染重組Elafin后二者的表達水平明顯降低。結(jié)論:Elafin真核表達載體成功構(gòu)建,初步發(fā)現(xiàn)Elafin可通過降低NF-κB的活性來下調(diào)MUC5AC的表達,為進一步深入研究其對氣道粘液高分泌的調(diào)節(jié)機制奠定了基礎(chǔ)。

Elafin;粘蛋白;脂多糖;核轉(zhuǎn)錄因子-κB

氣道粘液高分泌是慢性氣道炎癥性疾病的重要病理特征之一,也是目前呼吸系病函待解決的主要問題之一。氣道病理性粘液形成的主要原因是粘蛋白的過度表達,氣道粘蛋白（Mucin）的主要病理表型是MUC5AC。近幾年在氣道MUC5AC病理性表達機制方面國內(nèi)外學(xué)者進行了深入的研究,肯定了多種刺激因素引起MUC5AC高表達的重要作用,如吸煙、中性粒細胞彈性蛋白酶及脂多糖（Lipopolysac-charide,LPS）等[1-3]。Elafin作為體內(nèi)一種天然生態(tài)抗菌多肽,不僅是特異性的蛋白酶抑制劑,也是一個強有力的抗炎因子[4]。因此,獲取人工重組Elafin對慢性氣道炎癥性疾病的治療,特別是氣道粘液高分泌的治療極具研究和應(yīng)用價值。本研究克隆了全長人Elafin,定向重組至真核表達載體pEGFP-N1獲重組質(zhì)粒pEGFP-N1-Elafin,并給予LPS刺激,初步探討轉(zhuǎn)染天然內(nèi)生多肽Elafin對氣道粘蛋白基因MUC5AC表達的調(diào)節(jié)機制,為將重組人Elafin用于臨床治療慢性氣道炎癥性疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料 肺腺癌細胞株A549由重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院提供,正常人支氣管上皮細胞HBE16購自ATCC（美國標準培養(yǎng)收集所）;RPMI 1640培養(yǎng)基,胎牛血清購自Hyclone（美國）;從綠膿桿菌提取的LPS購自美國Sigma公司;兔抗Elafin多克隆抗體購自Abcam（英國）;鼠抗MUC5AC 45M 1單克隆抗體購自Neomarkers（美國）;Lipofectamine 2000購自Invitrogen（美國）;轉(zhuǎn)錄因子NF-κB熒光素酶報告基因質(zhì)粒pEGFP-N1、pNF-κB-luc和雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所（北京）;pRL-TK Renilla熒光素酶報告基因質(zhì)粒購自Promega（美國）;pMD18-T購自寶生物工程（大連）有限公司;HRP標記的羊抗兔IgG購自北京中山金橋生物技術(shù)公司;其余產(chǎn)品均為國產(chǎn)試劑。

1.2 方法

1.2.1 Elafin cDNA的獲取及原核載體 pMD18-TElafin的構(gòu)建 常規(guī)培養(yǎng)肺腺癌細胞株A549,提取細胞總RNA并行RT-PCR反應(yīng)Elafin引物序列為上游CCGGAATTCAGGGCCAGCAGCTTCTTGAT和下游CGGGATCCTCACTGGGGAACGAAACAGG。所得產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳,在368 bp處出現(xiàn)的條帶即為所需的Elafin基因片段。然后按DNA膠回收純化試劑盒（大連寶生物）說明書切膠回收上述Elafin基因條帶,并將其與pMD18-T均進行EcoRⅠ和BamH Ⅰ雙酶切。再次行DNA膠回收,以去除含EcoR Ⅰ和BamHⅠ位點的非特異性片段,提高連接效率。按T4DNA連接酶試劑盒（大連寶生物）說明書連接12小時,將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞,轉(zhuǎn)化過程設(shè)置陰性及陽性對照組,將轉(zhuǎn)化平板置于37℃,12小時后挑菌,加入5m l的LB液體培養(yǎng)基及5μl的氨芐霉素（100mg/ml）搖菌。12小時后提取質(zhì)粒,酶切及PCR鑒定質(zhì)粒構(gòu)建是否成功,并將重組質(zhì)粒樣品送Invitrogen公司行DNA測序。

1.2.2 真核載體pEGFP-N1-Elafin的構(gòu)建 因插入表達載體pEGFP-N1的序列如在真核細胞中表達,其序列需有翻譯啟動碼ATG,故我們在設(shè)計引物時,在上游引物中加入了ATG。根據(jù)Genebank所提供序列（25-378）,應(yīng)用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計引物:上游 CGGAATTCATGACGGCCAGCAGCTTCTTGAT和下游 CGGGATCCCTGGGGAACGAAACAGGCCA（由上海生工合成）,以構(gòu)建成功的 pMD18-T-Elafin為模板,進行PCR擴增反應(yīng),獲367 bp Elafin片段經(jīng)瓊脂糖電泳回收。將回收的Elafin基因片段和pEGFP-N1進行EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切并將酶切產(chǎn)物進行DNA膠回收。然后,按T4DNA連接酶試劑盒（大連寶生物）說明書連接12小時,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞,轉(zhuǎn)化過程設(shè)置陰性及陽性對照組。將轉(zhuǎn)化平板置于37℃,12小時后挑菌,加入5m l LB液體培養(yǎng)基及100μl的卡那霉素（30mg/m l）搖菌。12小時后提取質(zhì)粒,雙酶切鑒定質(zhì)粒構(gòu)建是否成功。

1.2.3 轉(zhuǎn)染 常規(guī)消化HBE16細胞,離心后棄上清,用無青鏈霉素及無胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細胞進行培養(yǎng),待細胞匯合至90%左右進行轉(zhuǎn)染,操作步驟按Lipofectamine 2000說明書進行。轉(zhuǎn)染設(shè)空白對照組,空質(zhì)粒組及重組質(zhì)粒組。轉(zhuǎn)染后24～48小時在熒光顯微鏡下觀察熒光,以此鑒定轉(zhuǎn)染是否成功及轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4 細胞分組 于6孔板中培養(yǎng)HBE16細胞,常規(guī)培養(yǎng)換液,待細胞融合至約80%時傳代,將細胞分為6組,每組3個復(fù)孔:（1）對照組:在無胎牛血清無雙抗的1640中繼續(xù)培養(yǎng)細胞;（2）LPS刺激組:無血清培養(yǎng)液中加入終濃度為10 ng/ml LPS;（3）LPS+pEGFP-N1組:行pEGFP-N1轉(zhuǎn)染,24小時后加入終濃度為 1 ng/ml的 LPS;（4）LPS+pEGFP-N1-Elafin組:行pEGFP-N1-Elafin轉(zhuǎn)染,終濃度為 1 ng/ml的LPS;（5）pEGFP-N1轉(zhuǎn)染組:行pEGFP-N1轉(zhuǎn)染;（6）pEGFP-N1-Elafin轉(zhuǎn)染組:行 pEGFP-N1-Elafin轉(zhuǎn)染。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后分別收集上清和細胞進行相關(guān)指標檢測,每組實驗重復(fù)4次。

1.2.5 Western blot檢測細胞內(nèi)Elafin蛋白的相對含量 棄培養(yǎng)液后加入細胞裂解液,冰浴20分鐘,4℃12 000 r/min離心15分鐘,測定蛋白濃度。取各組細胞蛋白10μg經(jīng)含15%的SDS-PAGE電泳分離,轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,5%脫脂牛乳封閉1小時,加入兔抗Elafin多克隆抗體（1∶1 000）孵育2小時,再用HRP標記的羊抗兔IgG（1∶10 000）孵育2小時。洗膜后經(jīng)ECL顯色,暗室曝光2分鐘。結(jié)果以與內(nèi)參照β-actin產(chǎn)物條帶的密度面積積分比值作為Elafin蛋白的相對含量。

1.2.6 熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測NF-κB的活性 常規(guī)培養(yǎng)HBE16細胞,將pNF-κB-luc及 pRLTK轉(zhuǎn)染入細胞,12小時后行 LPS刺激和（或）pEGFP-N1及pEGFP-N1-Elafin轉(zhuǎn)染,操作步驟按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書進行,以Renilla熒光素酶為內(nèi)參,用螢火蟲熒光素酶測定得到的RLU（Relative lightunit）值除以Renilla熒光素酶測定得到的RLU值,根據(jù)得到的比值來比較不同樣品間目的報告基因的激活程度。

1.2.7 ELISA法檢測細胞分泌的MUC5AC蛋白含量 吸取細胞上清液50μl包被96孔酶標板,4℃過夜,小牛血清室溫封閉 1小時,分別加小鼠抗MUC5AC單克隆抗體45M1（1∶100,用含0.05%Tween-20的PBS稀釋至50μl）孵育1小時,再加入100μl辣根過氧化物酶-羊抗小鼠IgG（1∶10 000）孵育1小時,經(jīng)四甲基聯(lián)苯胺過氧化物酶顯色后測各孔吸光度值（450 nm）,與標準品比較得出MUC5AC的相對值。

1.2.8 RT-PCR檢測ElafinmRNA和MUC5ACmRNA的表達 提取各組細胞總RNA,測A260/280為1.8～2.0,行 RT-PCR反應(yīng),各引物序列如下,Elafin:上游CGCTGCTTGAAAGATACTGAC、下 游-GCAGGGACTTAGGACCAGAT;MUC5AC:上游-TCAACGGAGACTGCGAGTACAC、下 游 5′-TCTTGATGGCCTTGGAGCA-3′;GAPDH:上游 3′-TCCCATCACCATCTTCCAG-5′、下游3′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-5′。反應(yīng)體系如下 :模板1μl,引物各 2μl（10 nmol/L）,TaKaRa Taq 0.5μl,10×PCRBuffer5μl dNTPM ixture 4μl,滅菌蒸餾水定容至50μl。反應(yīng)參數(shù)如下:94℃5分鐘,94℃30秒,60℃（MUC5AC）、61℃（Elafin）、55℃（GAPDH）均 30秒,72℃50秒,35個循環(huán),72℃10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,電泳結(jié)果經(jīng)光密度面積積分分析,以與管家基因GAPDHmRNA的比值作為目的基因mRNA的相對含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包分析,根據(jù)方差齊性與否分別采用參數(shù)檢驗和非參數(shù)檢驗,即齊性資料用單因素方差分析（ANOVA）,結(jié)果以±s表示,兩兩比較采用LSD檢驗,非齊性資料用秩和檢驗,結(jié)果以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Elafin基因的克隆及鑒定 從A549細胞中提取的總RNA,RT-PCR擴增后經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳,在368 bp處出現(xiàn)條帶即為Elafin基因片段（圖1）,此條帶行DNA膠回收后用于重組原核質(zhì)粒的構(gòu)建。

圖1 Elafin基因的克隆及瓊脂糖電泳鑒定Fig.1 Clone and identification of Elafin

圖2 pMD18-T-Elafin的酶切鑒定及DNA測序Fig.2 Restriction enzyme identification of pMD18-T-Elafin and its sequencing

2.2 原核質(zhì)粒pMD18-T-Elafin的酶切鑒定及DNA測序 重組質(zhì)粒（相對于未插入任何片段的pMD18-T陰性質(zhì)粒而言,亦稱其為陽性質(zhì)粒）pMD18-T-Elafin經(jīng)EcoRⅠ和BamH Ⅰ雙酶切鑒定構(gòu)建成功（圖2A）,符合預(yù)期目標。重組質(zhì)粒DNA測序結(jié)果見圖2B（由Invitrogen公司完成）,結(jié)果與GeneBank報道一致,進一步從基因水平確定重組質(zhì)粒pMD18-T-Elafin構(gòu)建成功。

2.3 重組質(zhì)粒pEGFP-N1-Elafin的酶切鑒定、轉(zhuǎn)染及重組Elafin的表達 重組質(zhì)粒（相對于未插入任何片段的pEGFP-N1陰性質(zhì)粒而言,亦稱其為陽性質(zhì)粒）經(jīng)EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切鑒定確定構(gòu)建成功（圖3A）;重組（陽性）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HBE16細胞 36小時后在熒光倒置顯微鏡下觀察,質(zhì)粒發(fā)出較強綠色熒光（圖3D）,以此證實轉(zhuǎn)染成功,且熒光越多,表明重組Elafin（recombinant Elafin,rec-Elafin）融合蛋白表達越多;空（陰性）質(zhì)粒因含有綠色熒光蛋白基因,故亦能發(fā)出綠色熒光,陰陽性質(zhì)?？捎蓹z測細胞是否表達Elafin mRNA和蛋白來區(qū)分,見結(jié)果2.4。

2.4 轉(zhuǎn)染重組Elafin對Elafin基因及蛋白水平的影響 LPS刺激對細胞內(nèi)基礎(chǔ)Elafin的基因及蛋白表達水平無明顯影響,轉(zhuǎn)染重組Elafin后Elafin基因轉(zhuǎn)錄水平顯著升高（圖4A）,同時細胞內(nèi)可檢測到大量rec-Elafin的表達（圖4B）,而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N1對Elafin基因及蛋白水平無明顯影響。

圖3 pEGFP-N1-Ela fin的酶切鑒定、轉(zhuǎn)染及重組Elafin的熒光鑒定Fig.3 Restriction enzyme identification of pEGFP-N1-Elafin and its transfection

2.5 轉(zhuǎn)染重組Elafin對NF-κB的活性的影響 LPS刺激HBE16細胞后,檢測到NF-κB（圖 5）的相對活性明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;轉(zhuǎn)染重組Elafin可下調(diào)LPS刺激引起的NF-κB的相對活性;而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N1對NF-κB的相對活性無明顯影響,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖4 LPS及轉(zhuǎn)染重組Elafin對Elafin基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白含量的影響Fig.4 Effects of LPS and rec-Elafin on the expression of Elafin mRNAand protein

圖5 LPS及轉(zhuǎn)染重組Elafin對NF-κB活性的影響Fig.5 Effects of LPS and rec-Elafin on NF-κB activity

圖6 各組細胞MUC5ACmRNA的表達及蛋白含量的檢測Fig.6 Exp ression of MUC5AC mRNA and protein in each group

2.6 轉(zhuǎn)染重組Elafin對MUC5AC蛋白及mRNA相對含量的影響 單獨LPS刺激后細胞內(nèi)MUC5AC蛋白（圖6A）及mRNA（圖6B）含量明顯高于對照組;在LPS刺激組轉(zhuǎn)染了重組Elafin后,MUC5AC蛋白及mRNA含量明顯降低;單純轉(zhuǎn)染重組Elafin組的MUC5AC蛋白及mRNA含量較對照組明顯降低,而MUC5AC蛋白及mRNA相對含量在轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N1后無明顯變化。

3 討論

Elafin是近些年發(fā)現(xiàn)的一種小分子（9.9 kD）抗彈力酶特異性保護因子,屬于“trappin”家族,此類蛋白的N末端由可變數(shù)目重復(fù)序列的6肽（Gly-Gln-Asp-Pro-Val-Lys）組成作為谷氨酰轉(zhuǎn)移酶底物的錨狀結(jié)構(gòu)[5]。呼吸道 Elafin主要是由肺泡上皮細胞、Clara細胞以及肺泡巨噬細胞產(chǎn)生,它具有保護細胞外基質(zhì)及上皮細胞免受中性粒細胞彈性蛋白酶破壞溶解的作用,并顯示出良好的抗菌作用及陽離子蛋白酶抑制作用[6]。Elafin這種多重有益效應(yīng)及其分子量小穿透性好的特點使其成為治療慢性氣道炎癥性疾病的極具潛質(zhì)和希望的候選靶物質(zhì),并且作為一種天然生態(tài)抗菌素,它可避免長期使用人工合成抗菌素易引起氣道菌群的失調(diào)。因此,獲取人工重組Elafin對慢性氣道炎癥性疾病的治療極具研究價值。本研究成功構(gòu)建了天然內(nèi)生多肽Elafin真核表達載體pEGFP-N1-Elafin,轉(zhuǎn)染正常人支氣管上皮細胞HBE16后細胞表達大量的Elafin蛋白,為在體外高效表達Elafin提供了可能,從而為更深入研究其抗炎、抗菌機制及效能奠定了基礎(chǔ)。

粘液高分泌是氣道慢性炎癥性疾病重要的病理變化之一,過多的粘液儲留于氣道導(dǎo)致反復(fù)的細菌感染,加大了發(fā)病率和死亡率。LPS可通過增強NF-κB的活性來上調(diào)MUC5AC基因的表達[7,8],而Elafin可通過抑制單核細胞中LPS上調(diào)的NF-κB的活性從而下調(diào)靶基因的表達水平[9]。因此,本研究以NF-κB為切入點,探討Elafin對LPS引起的MUC5AC高表達的影響。NF-κB是一個轉(zhuǎn)錄因子家族,激活的NF-κB可轉(zhuǎn)入核內(nèi)形成二聚體結(jié)合于靶基因啟動子上的特異性序列啟動基因轉(zhuǎn)錄[10]。在本研究中,LPS可上調(diào)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性,MUC5AC的表達亦明顯增強。轉(zhuǎn)染重組Elafin后,LPS所誘導(dǎo)的NF-κB的活性明顯受到抑制,伴有MUC5AC蛋白和轉(zhuǎn)錄水平的顯著降低,而空質(zhì)粒pEGFP-N1對上述指標無明顯影響。上述結(jié)果表明,Elafin可抑制炎性因子上調(diào)的NF-κB活性,使其不能與MUC5AC啟動子上NF-κB位點的順式作用元件結(jié)合,從而不能啟動MUC5AC基因的轉(zhuǎn)錄,達到降低MUC5AC病理性表達的目的。

Elafin突出優(yōu)勢在于其既可有效阻礙炎性損傷因子的作用,又可起確實的抗菌作用,故Elafin又是氣道抵御局部感染擴散的重要因素[11]。因Elafin具有抗菌多肽及彈性蛋白酶抑制劑的雙重身份,近幾年我們在其對氣道慢性炎癥性疾病的治療方面進行了初步的研究[5,6]。但目前國內(nèi)外在Elafin對氣道粘液高分泌的影響方面的研究甚少,本研究構(gòu)建了Elafin真核表達載體,并初步探討了內(nèi)生多肽Elafin對氣道粘液高分泌的調(diào)節(jié)機制。研究發(fā)現(xiàn)Elafin可籍以降低NF-κB的活性來下調(diào)脂多糖誘導(dǎo)的粘蛋白基因的高表達,為其在慢性氣道炎癥性疾病治療的后續(xù)研究、應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。同時也初步肯定了Elafin在治療氣道粘液高分泌方面的積極效應(yīng),為臨床治療慢性氣道炎癥性疾病提供了新的思考。

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[收稿2010-08-12 修回2010-11-01]

（編輯 倪 鵬）

Construction of Eukaryotic expression vector pEGFP-N1-Elafin and its effects on mucus hypersecretion in human airway epithelial cells

YUHong-Mei,LIQi,JuliyM·Perelman,VictorP·Kolosov,ZHOUXiang-Dong.DepartmentofRespiratoryMedicine,theSecondAffiliatedHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China

Objective:To constructeukaryotic expression vectorpEGFP-N1-Elafin and explore themechanism s of endogeny polypeptide elafin in regulatingmucus hypersecretion in airway epithelial cells.Methods:Elafin genewas successfully cloned by RT-PCR reaction.Eukaryotic exp ression vector pEGFP-N1-Elafin was constructed,identificated by restriction enzyme reaction（EcoRⅠ and BamHⅠ）and DNA sequencing,and transfected into HBE16 cells.Cellswere then stimulated by lipopolysaccharide（LPS）.After24 h,the levels of Elafin protein and mRNA were detected byWestern blotand RT-PCR respectively,the transcription activity of nuclear factorκB（NF-κB）were detected by luciferase reporter gene detection system,and the levels ofMUC5AC protein andmRNA were detected by ELISA and RT-PCR.Results:The levels of Elafin protein andmRNAwere obviously increased after transfection of recombinant Elafin into HBE16 cells,comparedwith LPSgroup or control group.Therewas anobvious increaseofMUC5AC protein production andmRNA expression,with elevationof NF-κB activity,all significantly higher than controlgroup.Transfected recombinantelafin reducedMUC5AC protein andmRNA level,inhibited NF-κB activity,compared with single LPS-stimulated group.Conclusion:Transfectionofendogeny polypeptide Elafinmay down-regulateMUC5AC overexpression by inhibition of NF-κB.

Elafin;Mucin;Lipopolysaccharide;Nuclear factorκB

R363

A

1000-484X（2011）05-0440-06

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.05.014

①本文為國家自然科學(xué)基金資助項目（30770951）、國家自然科學(xué)基金中俄國際合作項目（81011120108）和中俄政府間合作項目（2009:13-01）

②俄羅斯醫(yī)學(xué)科學(xué)院遠東呼吸生理與病理研究中心,布拉戈維申斯克675000

余紅梅（1982年-）,女,在讀博士,主要從事氣道粘液高分泌的發(fā)生機制及防治的研究,E-mail:yhm-023@sohu.com;

及指導(dǎo)教師:周向東（1963年-）,男,博士,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事氣道粘液高分泌的發(fā)生機制及防治的研究,E-mail:zxd999@263.net。