張 媛 羅 微 馬 驪 （南方醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院分子免疫學(xué)研究所,廣州 510515）

T淋巴瘤EL-4細(xì)胞雙受體表達(dá)研究①

張 媛 羅 微 馬 驪 （南方醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院分子免疫學(xué)研究所,廣州 510515）

目的:檢測T淋巴瘤EL-4細(xì)胞T細(xì)胞受體（T cell receptor,TCR）的表達(dá)情況,為進(jìn)一步研究T細(xì)胞等位基因排斥機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法:以小鼠脾細(xì)胞作為陽性對(duì)照,分別提取脾細(xì)胞和EL-4細(xì)胞mRNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,RT-PCR擴(kuò)增24個(gè)TCRBV家族CDR3區(qū),結(jié)合基因掃描（GeneScan）和基因測序技術(shù),對(duì)有表達(dá)的TCRBV家族進(jìn)行CDR3譜型和序列分析。結(jié)果:小鼠脾細(xì)胞24 BV家族均有表達(dá),各TCR BV家族CDR3譜型均呈高斯分布（Gaussian distribution）,表明24 BV家族均為多克隆性。EL-4細(xì)胞被同時(shí)檢測到TCR BV10和BV12家族表達(dá),CDR3譜型均呈單峰,兩個(gè)家族的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)測序鑒定證實(shí)確屬TCR序列,且均為框內(nèi)編碼。結(jié)論:EL-4細(xì)胞存在兩套框內(nèi)重排的TCRβ鏈,表明其TCRβ鏈可能存在等位基因排斥“缺陷”現(xiàn)象。本研究為探索T細(xì)胞等位基因排斥機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

EL-4細(xì)胞株;T細(xì)胞受體（TCR）;等位基因排斥“缺陷”;框內(nèi)重排

T淋巴細(xì)胞通過其表面受體（T cell receptor,TCR）特異性識(shí)別抗原。在T細(xì)胞發(fā)育成熟過程中,TCR胚系基因中可變區(qū)（Variable region,V）、多樣區(qū)（Diverse region,D）、連接區(qū)（Joining region,J）基因片段經(jīng)歷基因重組[1]。依據(jù)Burnett的克隆選擇學(xué)說,T細(xì)胞表面受體遵循“一個(gè)淋巴細(xì)胞一個(gè)抗原受體”的原則,通過等位基因排斥機(jī)制,即一個(gè)等位基因座上抗原受體鏈的組成和表達(dá)能夠抑制另一個(gè)等位基因座上V-（D）-J基因片段的進(jìn)一步重組,確保T細(xì)胞表面只存在一種TCR,表現(xiàn)單特異性抗原識(shí)別能力[2]。隨著對(duì)等位基因排斥機(jī)制研究的不斷深入,近年來,越來越多的學(xué)者們發(fā)現(xiàn),TCRα鏈存在等位基因排斥“缺陷”現(xiàn)象,即單克隆T細(xì)胞有兩套重排的α鏈基因,甚至在蛋白質(zhì)水平上檢測到兩種TCRα的表達(dá),而關(guān)于TCRβ鏈等位基因排斥“缺陷”的研究報(bào)道較少[3-8]。

EL-4細(xì)胞為C57BL/6鼠T淋巴瘤細(xì)胞,作為單一細(xì)胞系發(fā)育成熟的T細(xì)胞株,是研究T細(xì)胞等位基因排斥機(jī)制的理想模型[9]。TCRβ鏈互補(bǔ)決定區(qū)3（CDR3）是直接與抗原肽結(jié)合的位點(diǎn)。在TCRβ鏈胚系基因片段重排過程中,CDR3區(qū)基因由BV末端、BD片段、BJ前端以及重排時(shí)V-D與D-J之間的插入序列（VnDnJ）組成,既是TCR上變化最多樣的區(qū),也是在抗原特異性識(shí)別中起最關(guān)鍵作用的區(qū)[10]。依據(jù)CDR3可變區(qū)V基因序列的同源性,可將65個(gè)TCR BV基因分為24個(gè)基因家族（即TCR BV1-BV20基因家族,其中BV5和BV8各有三個(gè)亞家族）[11],不同T細(xì)胞克隆其TCRCDR3長度和序列有所不同,通過設(shè)計(jì)各家族上游引物和TCR BC共用下游引物,可擴(kuò)增出所有TCR BV家族的CDR3區(qū),即可檢測到T細(xì)胞中所有TCRβ鏈的表達(dá)[12]。本研究通過對(duì)EL-4細(xì)胞24個(gè)TCR BV家族分析發(fā)現(xiàn),該細(xì)胞存在兩套重排的TCRβ鏈,表明其TCRβ鏈存在等位基因排斥“缺陷”。本研究為進(jìn)一步探討T細(xì)胞等位基因排斥機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和細(xì)胞株 實(shí)驗(yàn)用C57BL/6小鼠（6～8周鼠齡）由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;CD4+T淋巴瘤細(xì)胞株EL-4由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購自上海生物制品研究所;RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司）;RNA提取試劑盒購自美國Omega Bio-Tek公司;第一鏈 cDNA合成試劑盒購自德國MBI Fermentas公司;去離子甲酰胺（美國Sigma公司）;凝膠回收試劑盒（美國Omega Bio-Tek公司）;DL2000 DNAMarker（日本TaKaRa公司）。

1.3 小鼠脾細(xì)胞懸液的制備 將C57BL/6小鼠拉頸處死,用75%酒精浸泡5分鐘,無菌條件下,取出小鼠脾臟并研磨,過200目不繡鋼篩制成單細(xì)胞懸液,將單細(xì)胞懸液輕輕加于淋巴細(xì)胞分離液上層,2 000 r/min水平離心20分鐘,吸取白色淋巴細(xì)胞層于一無菌離心管中,細(xì)胞計(jì)數(shù),用含10%胎牛血清的RPMI1640全培調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106ml-1。

1.4 有限稀釋法亞克隆EL-4細(xì)胞

1.4.1 小鼠飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備 拉頸處死C57BL/6鼠,70%酒精浸泡消毒10分鐘,用手術(shù)剪將小鼠腹部剪開一小口,剝開皮膚,露出腹腔。用注射器將4 ml RPMI1640溶液注入腹腔,用手指輕揉腹部1分鐘,用注射器回抽腹腔液體,加入離心管。1 000 r/min離心10分鐘。取上清,以含 10%胎牛血清的 RPMI1640完全培養(yǎng)液將細(xì)胞制成懸液。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/ml。將細(xì)胞種入96孔板,0.05m l細(xì)胞懸液/孔,置37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)24小時(shí)。

1.4.2 亞克隆EL-4細(xì)胞 計(jì)數(shù)EL-4細(xì)胞,取130個(gè)細(xì)胞重懸于6.5ml全培中,即20個(gè)細(xì)胞/ml,100 μl/孔加入已接種飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板A、B、C三排中,即2個(gè)細(xì)胞/孔。余下2.9ml細(xì)胞懸液補(bǔ)加2.9ml全培,等倍稀釋,即細(xì)胞濃度為10個(gè)/ml,100μl/孔加入上述96孔板的D、E、F三排中,即1個(gè)細(xì)胞/孔。余下2.2ml細(xì)胞懸液補(bǔ)加2.2ml全培,再等倍稀釋,即細(xì)胞濃度為5個(gè)/ml,100μl/孔,加入96孔板的G、H兩排中,即0.5個(gè)細(xì)胞/孔。培養(yǎng)4～5天,倒置顯微鏡下可觀察到小的細(xì)胞克隆團(tuán),補(bǔ)加全培100μl/孔。第8～9天時(shí),肉眼可見克隆細(xì)胞群,挑選單克隆團(tuán)的EL-4細(xì)胞,轉(zhuǎn)移至24孔板擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.5 引物設(shè)計(jì)與合成 參照文獻(xiàn)[13,14]合成TCR BV基因家族上游引物24條,TCR BC下游引物2條（內(nèi)側(cè)引物5′端帶Fam標(biāo)記,見表1）;由Invitrogen上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.6 總RNA提取和cDNA合成 按試劑盒條件,提取2×106個(gè) EL-4細(xì)胞、小鼠脾細(xì)胞總RNA,取 1μg總RNA作為模板,用OligdT作引物,cDNA反應(yīng)體系為40μl,按試劑盒條件合成cDNA。

表1 TCR BV24家族、TCR BC1、TCRBC2引物設(shè)計(jì)Tab.1 The primers of TVR BV 24 fam ily,TCR BC1,TCRBC2

1.7 TCR BV半巢式PCR 第一輪PCR反應(yīng)體系為25μl,含cDNA 模板1.2μl,10mmol/L dNTP 0.5μl,10×Buffer 2.5μl,25mmol/L氯化鎂 1.5μl,24個(gè)TCR BV家族上游引物0.8μl和共用TCRBC下游外側(cè)引物0.8μl,引物濃度均為10mmol/L,Taq DNA聚合酶0.65U。反應(yīng)條件為:94℃變性3分鐘;94℃1分鐘,55℃1.5分鐘,72℃2分鐘,40個(gè)循環(huán);72℃延伸10分鐘。取PCR產(chǎn)物8μl在2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳,于-20℃保存?zhèn)溆?第二輪PCR反應(yīng)體系25μl,含第一輪PCR產(chǎn)物2μl,10mmol/L dNTP 0.5 μl,10×Buffer 2.5μl,25 mmol/L氯化鎂1.5μl,24個(gè)TCRBV家族上游引物0.8μl,FAM熒光標(biāo)記的共用TCR BC下游內(nèi)側(cè)引物0.8μl,Taq DNA聚合酶0.65U。反應(yīng)條件為:94℃變性3分鐘;94℃1分鐘,55℃45秒,72℃1分鐘,40個(gè)循環(huán);72℃延伸10分鐘。

1.8 瓊脂糖凝膠電泳 取PCR產(chǎn)物8μl經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,110 V,24分鐘,采用凝膠成像系統(tǒng)照相,剩余產(chǎn)物-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 GeneScan分析 取TCR BV第二輪各家族帶熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物2μl,分別加入2μl去離子甲酰胺,0.5μl變性膠上樣緩沖液（25 mmol/L EDTA,50 mg/ml b lue dextran）,94℃變性 4分鐘后,每管取2μl在373DNA序列分析儀（ABI,PerkinElmer）中電泳2小時(shí)（6%變性聚丙酰胺凝膠）,計(jì)算機(jī)收集電泳過程中不同時(shí)間所出現(xiàn)的不同顏色和強(qiáng)度的熒光素,以顯示出不同的位置、高度、顏色和形態(tài)的峰,Gene Scan 672軟件分析。

1.10 PCR產(chǎn)物測序 經(jīng)GeneScan分析后,取單克隆的TCR BV家族PCR產(chǎn)物2μl為模板,相應(yīng)的上游V基因家族引物和下游不帶熒光標(biāo)記的BC引物各0.8μl,10 mmol/L dNTP 0.5μl,10×Buffer 2.5μl,25mmol/L氯化鎂1.5μl,Taq DNA聚合酶0.65U進(jìn)行二次PCR,總反應(yīng)體積為25μl。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化,送Invitrogen上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

2 結(jié)果

2.1 瓊脂糖凝膠電泳圖 2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,小鼠脾細(xì)胞24TCR BV家族PCR產(chǎn)物在250～500 bp位置均有清晰條帶（圖1）,EL-4細(xì)胞株BV10和BV12基因家族PCR產(chǎn)物顯示清晰條帶（圖2）。

2.2 GeneScan分析CDR3譜型圖 小鼠脾細(xì)胞和EL-4細(xì)胞TCR Vβ基因家族GeneScan 672軟件分析結(jié)果:小鼠脾細(xì)胞TCR BV各家族均為8個(gè)以上中間高、兩端低的鐘型峰圖,呈高斯分布（8個(gè)以上峰型）,相鄰兩條條帶大小相差3 bp（圖3）。EL-4細(xì)胞株BV10家族和BV12家族呈單峰（表2）。

圖1 小鼠脾細(xì)胞TCR BV家族PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 The products of TCR BV fam ily PCR ofmouse spleen cells analyzed on a 2%agarose gel

圖2 EL-4細(xì)胞TCR BV家族PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 The products of TCR BV fam ily PCR of EL-4 cell line analyzed on a 2%agarose gel

圖3 小鼠脾細(xì)胞TCRβ鏈24 BV家族CDR3譜型基因掃描圖Fig.3 GeneScan analyze of CDR3 spectratype of TCRβchain 24 BV gene fam ilies ofmouse spleen cells

表2 TCR BV10和BV12家族CDR3基因和蛋白序列分析Tab.2 Analysis of CDR3 gene and protein sequences of the TCR BV10和BV12 in EL-4 cell line

圖4 小鼠脾細(xì)胞TCR BV4的PCR產(chǎn)物基因掃描分析圖Fig.4 GeneScan distribution profiles of TCR BV4 in mouse sp leen cells

2.3 PCR產(chǎn)物片段大小和表達(dá)頻率分析 軟件自動(dòng)分析標(biāo)本中各TCR BV家族CDR3片段的長度和表達(dá)頻率。圖4列出小鼠脾細(xì)胞TCR BV4的片段大小和表達(dá)頻率分析圖。

2.4 EL-4細(xì)胞株TCR BV10和BV12家族PCR產(chǎn)物測序后CDR3基因和蛋白序列分析（見表2） 根據(jù)測序結(jié)果,按DDBJ、GeneBank及IMGT庫中TCR VDJC標(biāo)準(zhǔn)基因序列,鑒定EL-4細(xì)胞TCR BV10和BV12家族PCR擴(kuò)增序列均為TCR序列。

3 討論

本研究通過分析T淋巴瘤細(xì)胞株EL-4細(xì)胞TCR的表達(dá),檢測到該細(xì)胞存在兩套框內(nèi)重排的TCRβ基因。為明確該兩套TCR基因是同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞內(nèi),還是因EL-4細(xì)胞株突變?yōu)橐粋€(gè)混合細(xì)胞群而導(dǎo)致不同亞克隆株擁有不同TCRβ基因,我們對(duì)EL-4細(xì)胞株進(jìn)行了亞克隆,挑選出三株生長良好的亞克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng),提取其總RNA并RT-PCR擴(kuò)增24 TCR BV家族,結(jié)果表明,三個(gè)亞克隆株和母細(xì)胞株一樣,均有TCRBV10和BV 12表達(dá),且不同亞克隆株來源的BV10和BV12基因序列完全一致,表明BV10和BV12來源于單個(gè)克隆的EL-4細(xì)胞,且表達(dá)穩(wěn)定。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,EL-4細(xì)胞株存在兩套框內(nèi)重排的TCRβ鏈,表明其TCRβ鏈可能存在等位基因排斥“缺陷”。

依據(jù)經(jīng)典的免疫學(xué)理論,T細(xì)胞通過等位基因排斥機(jī)制確保一個(gè)淋巴細(xì)胞只表現(xiàn)單特異性抗原識(shí)別能力,作為早期細(xì)胞自身的耐受機(jī)制,等位基因排斥可以減少多特異性淋巴細(xì)胞的數(shù)量[15]。然而,自The Journalof Immunology雜志上報(bào)道了對(duì)白喉毒素特異的人T細(xì)胞株存在兩個(gè)框內(nèi)編碼的TCR Vβ基因之后,T細(xì)胞存在兩套重排TCR Vβ等位基因的現(xiàn)象才被相繼報(bào)道,表明TCR Vβ鏈的等位基因排斥并非準(zhǔn)確無誤[16]。

為何T細(xì)胞能夠同時(shí)存在兩套重排的TCR Vβ鏈?研究者們推測可能是發(fā)生了等位基因排斥“缺陷”,具體解釋為:（1）兩個(gè)等位基因座上編碼框內(nèi)的VDJβ同時(shí)發(fā)生重排,從而逃避了等位基因排斥的抑制機(jī)制[17]。（2）在T細(xì)胞發(fā)育的雙陽性階段（CD4+CD8+）,重組酶被異常激活,在TCRβ基因座上發(fā)生二次重排,使得單個(gè)細(xì)胞表達(dá)兩條β鏈形成兩種不同的TCR[18];（3）等位基因排斥取決于兩條染色體上VDJβ重排的異步性,pre-TCR的作用是傳導(dǎo)至少存在一個(gè)Vβ鏈信號(hào)而不是只能有一個(gè)Vβ鏈的信號(hào)[18];（4）第一個(gè)等位基因座上功能性重排的Vβ鏈表達(dá)與抑制第二個(gè)等位基因座上V-D-J重排存在時(shí)間的延遲,使得反饋抑制作用不能及時(shí)發(fā)揮作用[19]。

由于抗原受體的等位基因排斥由一系列復(fù)雜的機(jī)制調(diào)控,因此,盡管對(duì)等位基因排斥機(jī)制的研究已有數(shù)十年的歷史,引起等位基因排斥“缺陷”的原因目前仍是個(gè)迷。本研究發(fā)現(xiàn)EL-4細(xì)胞株存在兩套重排的TCRβ鏈,表明其TCRβ鏈存在等位基因排斥“缺陷”。EL-4細(xì)胞β鏈等位基因排斥“缺陷”的發(fā)生機(jī)制是什么?該現(xiàn)象究竟是等位基因排斥“缺陷”的偶然性?還是EL-4細(xì)胞作為T淋巴瘤細(xì)胞株這樣一種特殊細(xì)胞群的代表所表現(xiàn)出來的某種特性?等位基因排斥“缺陷”機(jī)制與腫瘤發(fā)生發(fā)展之間是否存在某種關(guān)聯(lián)?這些問題都有待我們更深入的研究和探討。

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[收稿2010-11-12]

（編輯 倪 鵬）

Expression of two distinct T cell receptorsby EL-4 T lymphoma cells

ZHANGYuan,LUOWei,MALi.InstituteofMolecularImmunology,SchoolofBiotechnology,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China

Objective:To investigate the expression of T cell receptor（TCR）inEL-4 T lymphoma cells.Methods:Mouse spleen cells were used as positive control,total RNA was isolated from mouse spleen cells and EL-4 cell line.Comp lementarity Determining Region 3（CDR3）of24 TCR BV gene subfamilieswas amplified by the reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）.To determ ine the spectratypes and sequences of CDR3 region of TCRBV subfam ilies expressed by EL-4,PCR productswere analyzed by TCRGeneScan Technique and DNA sequencer,respectively.Results:24 TCRBV subfam ilies ofmouse spleen cellswere polyclonal,the spectratypes of TCRCDR3 regionwere showed Gaussian distribution.EL-4 was shown detected the expression of TCR BV10 and BV12 simultaneously,spectratypes of which showed single peak,and the TCR sequences of BV10 and BV12 were confirmed by DNA sequencer and they were both in-frame rearrangements.Conclusion:Two sets of in-frame rearrangements of TCRβchain exist in EL-4,and theremaybe‘defects'in allelic exclusion in TCRβchain.It provides abasis for future research of allelic exclusionmechanism.

EL-4 cell line;T cell receptor（TCR）;‘Defect'in allelic exclusion;In-frame rearrangement

R392.12

A

1000-484X（2011）05-0404-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.05.005

①本文受國家自然科學(xué)基金（30972680、30771952）和教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃（NCET-07-0410）資助

張 媛（1987年-）,女,在讀碩士,E-mail:zhangy_1987@126.com;

及指導(dǎo)教師:馬 驪（1971年-）,女,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事T細(xì)胞識(shí)別活化的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究,E-mail:maryhmz@126.com。