劉繼龍

不同的培養(yǎng)方法對鼠胚體外發(fā)育的影響

劉繼龍

目的比較鼠胚在不同的培養(yǎng)體系中的體外發(fā)育情況，探討培養(yǎng)液的體積對體外培養(yǎng)的影響。方法把收集的小鼠2-細胞胚胎分成兩組，A組于20μl培養(yǎng)液的微滴中培養(yǎng)，B組與50μl培養(yǎng)液的微滴中培養(yǎng)，觀察胚胎發(fā)育情況。結果96 h后A、B組的囊胚形成率分別為83.64%和81.63%，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結論適當體積的培養(yǎng)滴可促進胚胎的體外發(fā)育。

小鼠;胚胎;囊胚;體外培養(yǎng)

小鼠卵子體外受精技術是研究受精生理的重要手段，而研究小鼠胚胎體外發(fā)育是研究哺乳動物胚胎發(fā)育的常規(guī)方法之一。為提高體外受精-胚胎移植(IVF-ET)的成功率，許多學者對維持受精卵適宜穩(wěn)定的環(huán)境進行了探索［1，2］。選擇適宜的培養(yǎng)條件，是獲得較高成功率的前提。本文就微滴的體積大小對2-細胞鼠胚體外發(fā)育的影響進行了研究。旨在探討不同的培養(yǎng)方法對胚胎體外發(fā)育潛能的影響，并為人胚胎體外培養(yǎng)提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 昆明種小白鼠，購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，體重為25～35 g，按照SPF級實驗動物飼養(yǎng)標準條件飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 鼠胚采集 選擇4～6周齡雌鼠，于腹腔注射人絕經(jīng)期尿促性腺激素(hMG)10 IU/只。46～48 h后注射人絨毛膜促性腺激素(hCG)10 IU/只。于注射hCG當晚合籠過夜。第二天將陰栓陽性者挑選出來。注射hCG后42～46 h用頸椎脫臼法處死陰栓陽性雌鼠，取出輸卵管。在體視鏡下劃破輸卵管壺腹部，收集其中的2-細胞期胚胎，并用含10%SPS的HTF沖洗3遍，再在培養(yǎng)液中沖洗1遍，選取優(yōu)質(zhì)胚胎繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 體外培養(yǎng) 本實驗采用微滴法培養(yǎng)。于培養(yǎng)前一天按不同的方案做好微滴，并覆蓋礦物油，放入37℃，5%CO2，飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中過夜平衡，將收集的優(yōu)質(zhì)胚胎隨機分成兩組，A組于20μl培養(yǎng)液的微滴中培養(yǎng)，B組與50 μl培養(yǎng)液的微滴中培養(yǎng)。胚胎在37℃、5%CO2和飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)96 h，每隔24 h觀察鼠胚發(fā)育的情況并記錄。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 10.0分析軟件對所得數(shù)據(jù)進行顯著性檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

采用體內(nèi)受精的方法獲取2-細胞胚胎，在相同的培養(yǎng)條件下，A組分裂為4-細胞胚胎的分裂率為89.09%，B組分裂為4-細胞胚胎的分裂率為92.86%，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);A組的囊胚形成率為83.64%，B組的囊胚形成率為81.63%，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，但A組的囊胚形成率比B的稍高(見表1)。

表1 不同的培養(yǎng)方法對小鼠早期胚胎體外發(fā)育的影響

3 討論

隨著人類輔助生殖技術的不斷發(fā)展，體外受精-胚胎移植技術現(xiàn)已成為治療不育不孕的主要手段之一。人類輔助生殖技術包括卵母細胞的體外受精、胚胎的早期體外培養(yǎng)及胚胎移植等過程，這一系列過程要求有一個穩(wěn)定的模擬母體內(nèi)發(fā)育的體外培養(yǎng)環(huán)境及嫻熟的技巧。在體外培養(yǎng)過程中，所有與卵子、精子、胚胎接觸的耗材和試劑及環(huán)境，均有可能存在危害胚胎的因素［1］。活性氧是造成卵母細胞質(zhì)量下降和胚胎發(fā)育不良的重要因素之一。胚胎培養(yǎng)液中的活性氧的來源可能來自胚胎的周圍環(huán)境。它會引起早期胚胎發(fā)育停滯和延遲［3］。另外，由于開啟培養(yǎng)箱引起培養(yǎng)箱內(nèi)外氣體交換，室內(nèi)空氣消毒后殘留的臭氧也是培養(yǎng)液活性氧升高的主要原因之一。

本研究結果表明在體積為20μl與50μl的微滴中培養(yǎng)，2-細胞鼠胚的囊胚形成率差異無統(tǒng)計學意義(83.64%vs 81.63%，P＞0.05)。但在20μl的微滴中培養(yǎng)的2-細胞鼠胚發(fā)育到囊胚階段的胚胎數(shù)比在50μl的多，這可能是由于在整個體外發(fā)育過程中胚胎在20μl微滴中受到外界的影響較小而造成。培養(yǎng)基可以吸收部分污染物，如果微滴的體積過大，其與外界環(huán)境的接觸面就越大，則溶解于培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)就越多，胚胎受到的侵害面積就越大，從而影響胚胎的發(fā)育。而較小體積的液滴由于與外界的接觸面小，降低了氧化損傷的風險［4］，其提供的培養(yǎng)環(huán)境相對于大液滴或者整個培養(yǎng)箱而言是一個小環(huán)境，因此可以把由大氣候/環(huán)境發(fā)生改變而產(chǎn)生的有害因素通過小環(huán)境的微調(diào)作用而緩減，使培養(yǎng)胚胎受到的影響降到最低限度，很好地保護胚胎發(fā)育。綜上所述，小鼠胚胎體外培養(yǎng)實驗除了可以使新建立的輔助生殖實驗室熟練IVF的基本操作技能外，還可以為建立一套比較完善的胚胎培養(yǎng)體系提供實驗依據(jù)，是開展人類輔助生殖技術的基礎。選擇適量體積的微滴可以有效地降低外界因素對胚胎發(fā)育的影響，為胚胎體外培養(yǎng)提供一個穩(wěn)定良好的微環(huán)境。

［1］王利紅，連方.兩種2-細胞鼠胚體外培養(yǎng)方法比較.中國比較醫(yī)學雜志，2009，19(11):67-69.

［2］Suzuki C，Yoshioka K，Sakatani M，et al.Glutamine and hypotaurine improves intracellular oxidative status and in vitro development of porcine preimplantation embryos.Zygote，2007，15(4):317-324.

［3］Guenn P，EiMouatssim S，Menezo Y.Oxidative stress and protection against reactive oxygen species in the pre-implantation embryo and its surroundings.Hum Reprod Update，2001，7(2):175.

［4］Bedarwy MA，F(xiàn)alcone T，Mohamed MS，et al.Differential growth of human embryos in vitro;Role of reactive oxygen species.Fertil Steril，2004，82(3):593.

Effects of difference culturem ethods on development ofmouse em bryos in vitro

LIU Ji-long．Maternity and Child Health Hospital of Qinzhou，Guangxi53500，China

ObjectiveTo compare the mouse embryos of development status of difference culture methods in vitro，and explore the affect of volume of cultare solutior for culture in vitro.M ethods Mouse embryos at the 2-cell stage collected after mating were divided into two group.Group A was cultured in 20μl of medium volume，group B was cultured in 50μl ofmedium volume.The embryonic developmentwas observed.ResultsThe blastocyst formation rates at96 hours in group A and Bwere 83.64%and 81.63%respectively.Itwas no difference of the blastocyst rates in group A and B(P＞0.05).ConclusionItmaybe improve the development ofmouse embryos in vitro by appropriatemedium volume.

Mouse;Embryo;Blastocyst;In vitro culture

535000 欽州市婦幼保健院