侯宇 張曼 王文剛

波依定對壓力負(fù)荷心肌肥厚大鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因c-myc表達(dá)的影響

侯宇 張曼 王文剛

目的探討波依定(非洛平緩釋片)對升主動脈縮窄壓力超負(fù)荷心肌肥厚大鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因c-myc表達(dá)的影響。方法將升主動脈縮窄術(shù)后心肌肥厚Wistar雌性大鼠隨機分為2組，心肌肥厚組，給予生理鹽水，1次/d灌胃(n=10);治療組，給予波依定，1次/d灌胃(n=10);治療4周。同時制備模型設(shè)置假手術(shù)組作為對照(n=10)，不予處置。觀察各組大鼠各項指標(biāo)變化。結(jié)果心肌肥厚鼠心肌細(xì)胞c-myc蛋白表達(dá)顯著增高，波依定藥物治療4周后，心肌細(xì)胞內(nèi)c-myc蛋白表達(dá)降低。結(jié)論心肌細(xì)胞內(nèi)c-myc蛋白表達(dá)與心肌肥厚密切相關(guān)，波依定可降低肥厚心肌內(nèi)c-myc蛋白表達(dá)，緩解心肌肥厚癥狀。

心肌肥厚;波依定;細(xì)胞凋亡

慢性心力衰竭(CHF)的特征是心功能進(jìn)行性下降，其機制目前仍不完全清楚，越來越多觀點認(rèn)為在代償性肥厚的心臟心肌細(xì)胞不斷丟失，并被膠原纖維替代，由于收縮單元不斷減少，使心功能不斷下降［1］。本研究觀察波依定(非洛平緩釋片)對升主動脈縮窄壓力超負(fù)荷心肌肥厚大鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因c-myc表達(dá)的影響，探討波依定這種鈣離子拮抗劑防治心肌肥厚發(fā)生、發(fā)展的作用機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 健康純種雌性Wistar大鼠(100～150)g，30只(由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供);主要試劑:c-myc一抗(武漢博士德生物公司提供)。

1.2 建立大鼠升主動脈縮窄術(shù)模型及假手術(shù)組對照:按包偉珂等［2］法建立大鼠升主動脈縮窄術(shù)模型，純種雌性Wistar大鼠，體重100～150 g。將升主動脈縮窄術(shù)后12周，心肌肥厚雌性Wistar大鼠隨機分為2組，心肌肥厚組(生理鹽水，1次/d，灌胃4 周)、波依定治療組(10 mg/kg，1 次/d，灌胃 4周)，每組10只大鼠。假手術(shù)組:純種雌性Wistar大鼠10只，體重100～150 g，在升主動脈相同部位套環(huán)但不結(jié)扎血管，余同上，術(shù)后觀察24周。

1.3 血液動力學(xué)指標(biāo)測定 術(shù)后觀察期滿，10%氯化鉀(2 mmol/L，1 ml/只)處死大鼠后，測體重，取出心臟，去除心房、大血管及心臟外結(jié)締組織，沖洗干凈，濾紙吸干后稱量左室重量，計算左室肥厚指數(shù)左室重量/體重。

1.4 免疫組化法檢測心肌組織c-myc蛋白水平表達(dá) 取石蠟標(biāo)本相應(yīng)部位的連續(xù)切片4張，采用免疫組化ABC顯色法顯色，DAB棕色反應(yīng)顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。用已知陽性切片做陽性對照，用PBS代替一抗做陽性對照。陽性結(jié)果判斷:胞漿或胞膜呈棕黃色為陽性表達(dá)。參照Simler等標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行染色強度分級［3］:(-):胞漿及胞膜無明顯染色，放大倍數(shù)為40×10時仍難辨認(rèn);(+):淺著色，胞漿及胞膜內(nèi)部分淺棕色，放大倍數(shù)為40×10時可辨認(rèn)，但著色弱，放大倍數(shù)為10×10時難辨認(rèn);(++):中度著色，胞漿及胞膜內(nèi)均淺棕色，放大倍數(shù)為10×10時可辨認(rèn);(+++):強著色，胞漿及胞膜內(nèi)均深棕色，放大倍數(shù)為10×10時能清楚辨認(rèn)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 11.5軟件包里進(jìn)行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組內(nèi)比較采用t檢驗，組間比較采用q檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 各組大鼠(除假手術(shù)組外)均未出現(xiàn)明顯呼吸困難、水腫、進(jìn)食困難、尿少等心力衰竭癥狀。心肌肥厚組因嚴(yán)重感染癥狀死亡一只，其余組未見大鼠死亡。

表1 左室重量、體重結(jié)果(±s)

表1 左室重量、體重結(jié)果(±s)

注:①與假手術(shù)組比較＊P＜0.05，＊＊P＜0.01;②與心肌肥厚組比較△P＜0.05，△△P＜0.01;體重組間對比，q=0，P＞0.05;左室重量組間對比，q=273.41、273.41、140.85，P ＜0.01

N(只) 體重(g) 左室重量(mg)10 238.10±16.60 727.8±4.64心肌肥厚組 9 238.56±5.08 1245.00±14.62＊＊波依定治療組 10 238.00±2.98 903.00±21.71假手術(shù)組＊＊△△

2.2 左室重量、體重及左室重量/體重(左室肥厚指數(shù)) 心肌肥厚組大鼠左室肥厚指數(shù)較假手術(shù)組明顯增加。與心肌肥厚組相比，波依定治療組左室肥厚指數(shù)下降(見表1)。

圖1 假手術(shù)組心肌組織c-myc表達(dá)(免疫組化法) 圖2 心肌肥厚組心肌組織c-myc表達(dá)(免疫組化法)圖3 治療組心肌組織c-myc表達(dá)(免疫組化法)

2.3 免疫組化法檢測心肌組織c-myc蛋白水平表達(dá):應(yīng)用免疫組化法檢測心肌組織c-myc蛋白水平表達(dá)，心肌肥厚組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)c-myc蛋白表達(dá)呈(+++)，波依定治療組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)c-myc蛋白表達(dá)呈(+～++)，假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)c-myc蛋白表達(dá)呈(-～+)(見圖1、2、3)。

3 討論

細(xì)胞凋亡是由細(xì)胞內(nèi)的凋亡相關(guān)基因直接控制，多種細(xì)胞內(nèi)、外誘導(dǎo)因素可通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，構(gòu)成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，啟動細(xì)胞凋亡進(jìn)程。凋亡是缺血和非缺血性心肌病心肌細(xì)胞死亡的形式之一，在心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用［4］。凋亡相關(guān)基因包括死亡受體和死亡受體配體基因家族(如Fas和FasL等)、Bcl-2基因家族(如Bcl-2、Bcl-XL及Bax等)，P53及ICE、c-myc基因家族等，根據(jù)基因表達(dá)產(chǎn)物對細(xì)胞凋亡過程的影響，可將其分為促進(jìn)凋亡基因(如Fas、FasL和 Bax、c-myc等)和抑制凋亡基因(如Bcl-2、Bcl-XL等)。c-myc在有足夠生長因子時，促進(jìn)細(xì)胞增殖分裂，抑制凋亡。在沒有足夠生長因子時，抑制細(xì)胞增殖分裂，誘導(dǎo)凋亡。

本研究結(jié)果顯示，心肌肥厚大鼠c-myc水平明顯增加，提示c-myc蛋白水平增加參與心肌肥厚大鼠心肌細(xì)胞凋亡亢進(jìn)的信號傳遞。應(yīng)用波依定治療可降低c-myc表達(dá)，且與左室重量結(jié)果改變相符，這可能是其改善心肌肥厚的主要機制。提示波依定對促進(jìn)凋亡基因c-myc表達(dá)的作用可能是波依定抗凋亡作用的重要機制之一。

通過本實驗研究使我們對波依定這種鈣拮抗劑作用有了更深層次的理解。波依定抗心肌肥厚作用機制主要在于其可有效改善心肌肥厚大鼠心功能，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因cmyc表達(dá)。波依定影響心肌細(xì)胞凋亡調(diào)控基因表達(dá)的機制尚不清楚。心肌肥厚以后細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)紊亂表現(xiàn)為胞漿內(nèi)鈣濃度不可控制地增高，鈣內(nèi)流和聚集被認(rèn)為是死亡的共同途徑。波依定可有效地降低心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，改善細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)紊亂所致的細(xì)胞損傷，可能是其抑制肥厚心肌細(xì)胞凋亡的重要機制。

［1］Bing OH.Hypothesis:apoptosismay be amechanism for the transition to heart failure with chronic pressure overload.JMol Cell Cardiol，1995，27(2):847-851.

［2］包偉珂，柏樹令，王軍.升主動脈縮窄心衰鼠模型制作及臨床意義.中國臨床解剖學(xué)，1999，17(1):366-367.

［3］Li Z，Bing OH，Long X，et al.Increased cardiomyocyte apoptosis during the transition to heart failure in the spontaneously hypertensive rat.Am JPhysiol，1997，272(5):2313-2319.

［4］Sam F，Sawyer DB，Chang D L，etal.Progressive left ventricular remodling and apoptosis late after myocardial infarction in mouse heart.Am JPhysiol Heart Circ Physiol，2000，279(1):422-428.

［5］徐瑞，張運，張梅，等.SHR心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度改變與左室肥厚和功能的關(guān)系.中國病理生理雜志，2003，19(5):642-644.

Effects of Plendil on the expression of c-m yc of cardiacm yocyte of cardiom yopathy m odel of pressure o- verload rats

HOU Yu，ZHANGMan，WANGWen-gang．Departmentof Cardiology，Affiliated Fengtian Hospital of Shenyang Medical College，Shenyang 110024，China

ObjectiveTo study the effects of Plendil on the expression of c-myc of cardiacmyocyte of cardiomyopathy pressure overload ratmodels subsequent to coarctation of ascending aorta.MethodsAmodel of cardiomyopathy induced by coarctation of ascending aorta was used in this study.20 femaleWistar cardiomyopathy rats were divided randomly into two groups(n=10).The control group

saline butfer(once a day).The treatment group received Plendil(once a day).Treatment time was 4 weeks.Ratio of LV weight to body weight，expression of c-myc were investigated in the two groups and sham operation group.Resultsc-myc expression was higher in cardiomyopathy when compared with control.Plendil could decrease the expression of c-myc level.ConclusionThese result indicated that cardiomyopathy was probably related to activating of cmyc.Plendilmay contribute to the observed beneficial effects on cardiomyopathy by the decrease of c-myc expression.

cardiomyopathy;Plendil;Cell apoptosis

110024 沈陽醫(yī)學(xué)院奉天醫(yī)院循環(huán)內(nèi)科

張曼 沈陽醫(yī)學(xué)院附屬奉天醫(yī)院循環(huán)內(nèi)科