李傳響

不同廠家紅霉素軟膏微生物限度檢查方法驗(yàn)證研究

李傳響

目的建立紅霉素軟膏的微生物限度檢查方法。方法 人為加入5種陽性對(duì)照菌，測(cè)定其回收率。結(jié)果根據(jù)回收率試驗(yàn)結(jié)果，判定紅霉素軟膏對(duì)細(xì)菌的抑菌作用的強(qiáng)弱。結(jié)論必需采用離心集菌薄膜過濾法才能清除樣品的抑菌作用，該法可用于紅霉素軟膏的微生物限度的檢查。

紅霉素軟膏;微生物限度;回收率

(如金黃色葡萄球菌，肺炎鏈球菌等)，對(duì)衣原體等也有抑菌作用。筆者在反復(fù)驗(yàn)證多個(gè)廠家紅霉素軟膏微生物限度檢查方法時(shí)，發(fā)現(xiàn)常規(guī)法，培養(yǎng)基稀釋法均不適用于該制劑的微生物限度檢查，而離心集菌薄膜過濾法均可適用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 HTY-601型集菌儀(杭州泰林醫(yī)療機(jī)械廠);紅霉素軟膏(6個(gè)廠家分別編號(hào)為S1～S6);大腸埃希菌;枯草芽孢桿菌;金黃色葡萄球菌;銅綠假單胞菌;白色念珠菌;黑曲霉菌種均系中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。營(yíng)養(yǎng)瓊脂，玻瑰紅鈉瓊脂，膽鹽乳糖，pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨等培養(yǎng)基均系牛?；蛏锕旧a(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備 金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌菌液：取上述菌種的新鮮培養(yǎng)物接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基10 ml中，經(jīng)35℃培養(yǎng)24 h，再將上述各菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍級(jí)分別稀釋至10-7、10-5、10-7，10-6，使以上各菌含菌量約為 50 ～ 100 cfu/ml，備用。

1.2.2 白色念珠菌液 取該菌種新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁培養(yǎng)基中，經(jīng)25℃ 培養(yǎng)36 h，再取該菌液體培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至10-5，備用。

1.2.3 黑曲霉 取黑曲霉新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基，25℃ 培養(yǎng)7 d，再取該斜面培養(yǎng)物，加4 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液洗下黑曲霉孢子，吸取孢子懸液1 ml，加0.9%無菌氯化鈉溶液適量稀釋，用標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁，濁度相當(dāng)后，取1 ml稀釋后的孢子懸液，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至10-4，備用。上述各株菌的培養(yǎng)物均為第3代的培養(yǎng)物。

1.2.4 供試液制備 參照關(guān)資料文獻(xiàn)［1～6］的方法，取本品10g，加無菌十四烷酸異丙酯20 ml及玻璃珠，充分振搖，分散均勻，再加入0.9%無菌氯化鈉溶液至100 ml，充分振搖，萃取，置8℃環(huán)境中靜置分層，取下層部分作為供試液。

1.2.5 回收率測(cè)定 試驗(yàn)組(A組)：取供試液1 ml和試驗(yàn)菌液1 ml，注入平皿，立即傾注相應(yīng)的培養(yǎng)基，平行制備2皿，依法測(cè)定其菌落數(shù)［1］。培養(yǎng)基稀釋法：取供試液1 ml，分注5個(gè)平皿中，使成0.2 ml/皿;取供試液1 ml，分注2個(gè)平皿中，使成0.5 ml/皿，再依次加入試驗(yàn)菌。離心集菌薄膜過濾法：取供試液1 ml，加入200 ml稀釋液中混合均勻后，經(jīng)薄膜過濾并沖洗，沖洗量分別為200、400、500、600、800 ml，在最后一次沖洗液中加入試驗(yàn)菌，濾干，取出薄膜貼于瓊脂培養(yǎng)基平板上。菌液組(B組)：依法測(cè)定;供試品組(C組)：取規(guī)定量的供試液，除不加陽性菌外，依法測(cè)定;稀釋劑對(duì)照組(D組)：用相應(yīng)的稀釋液替代供試品，加入試驗(yàn)菌，依法測(cè)定。

1.2.6 檢查方法確定 常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法：先挑選金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌作為試驗(yàn)菌。采用常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法分別進(jìn)行回收率試驗(yàn)，再據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果，確定計(jì)數(shù)方法并進(jìn)行全菌種驗(yàn)證。薄膜過濾法［7］：經(jīng)薄膜過濾法，用600 ml沖洗液沖洗后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)及回收率測(cè)定。

1.2.7 檢查方法驗(yàn)證 取不同廠家的樣品，按確定的方法對(duì)5株實(shí)驗(yàn)菌進(jìn)行回收率試驗(yàn)。

1.2.8 控制菌檢查方法確立與驗(yàn)證 外用消炎制劑，都不得檢出金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌，故以此二菌為驗(yàn)證菌株，以大腸埃希菌為陰性對(duì)照菌。分別作為試驗(yàn)組和對(duì)照組。試驗(yàn)組取供試液10 ml，加入適量的培養(yǎng)基中，按藥典附錄下的金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢查，應(yīng)檢出該菌株。采用低速離心集菌薄膜過濾法時(shí)，取適量供試液，500r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心5 min，取上清液10 ml，加至稀釋液200 ml中混合均勻，經(jīng)薄膜過濾，沖洗，在最后一次沖洗液中加入驗(yàn)證菌株，再加入相應(yīng)的增菌液100 ml，按規(guī)定培養(yǎng)。陰性菌對(duì)照組，不得檢出。依次采用常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法、離心薄膜過濾法。

2 結(jié)果

2.1 方法預(yù)試驗(yàn)結(jié)果見表1?？梢姌悠穼?duì)細(xì)菌有明顯抑制作用，對(duì)真菌無抑制作用。因此，不可用常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，但常規(guī)方法適用于霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)檢查。薄膜過濾法預(yù)試結(jié)果顯示，細(xì)菌的回收率都高于70%以上［8］。因此可確定用薄膜過濾法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)檢查，用常規(guī)法進(jìn)行霉菌及酵母菌的計(jì)數(shù)檢查。

表1 常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法回收率預(yù)試驗(yàn)結(jié)果(%)

2.2 方法驗(yàn)證結(jié)果見表2。結(jié)果顯示3次平行度驗(yàn)證的回收率均達(dá)到了70%以上，說明所用方法符合2005年版中國(guó)藥典的規(guī)定。

表2 不同廠家的樣品驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.3 依據(jù)控制菌檢查方法驗(yàn)證后，結(jié)果表明，金葡菌和銅綠菌以低速離心集菌薄膜過濾法，沖洗量以400 ml最佳沖洗量，能夠有效去除該類藥品的抑菌活性。

3 討論

紅霉素軟膏對(duì)真菌幾乎無抑制作用，因此可用常規(guī)方法進(jìn)行霉菌及酵母菌檢查。但對(duì)細(xì)菌有很強(qiáng)的抑制作用，但細(xì)菌檢查以低速離心集菌薄膜過濾法，沖洗量600 ml/膜最佳?？刂凭鷻z查，采用低速離心集菌薄膜過濾法，以400 ml沖洗量為宜。薄膜過濾法時(shí)，沖洗量宜采用少量多次的梯度沖洗法，有利于供試液中微生物的回收，并先加入到一定量的稀釋液中，有助于細(xì)菌分散均勻，益于過濾。因驗(yàn)證工作量大，為盡快掌握驗(yàn)證方法，先以少數(shù)敏感菌進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，可以快速找準(zhǔn)檢測(cè)方法。紅霉素軟膏的基質(zhì)全是油包水型的，不易溶解于水中，因此加入無菌十四烷酸異丙酯，無菌的玻璃珠振搖，可以有效地溶解軟膏，分散均勻，同時(shí)置于8℃以下的環(huán)境中靜置分層，有利于將水層分離出來做為供試液。

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(二部).北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005;附錄XIH：附錄89-98

［2］ 于榮，李海妮，邢俊生.諾氟沙星軟膏微生物限度檢查方法的建立和驗(yàn)證.中國(guó)藥物與臨床，2009，9(9)：831-833

［3］ 陸益萍.3種軟膏劑的微生物限度檢查驗(yàn)證.安徽醫(yī)藥，2008，12(4)：318-319.

［4］ 馬曉璇，李汶，溫玉瑩.2種含硫磺制劑的微生物限度檢查方法驗(yàn)證.今日藥學(xué)，2009，19(2)：50-51.

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［7］ 宋勤，杜平華.中成藥微生物限度檢查法的探討.中國(guó)藥事，2006，20(1)：46-48.

［8］ 李秋菲，唐振宏，張芹，等.4種大環(huán)內(nèi)酯類藥物微生物限度檢查方法驗(yàn)證.中國(guó)藥業(yè)，2008，17(13)：20-21.

Method Validation of microbial limit Test for erythromycin oiintment

LI Chuan-xiang.Anqing Institute for Food and Drug Control，Anqing 246001，China

ObjectiveTo establish the microbial limit test method for Erythromycin Ointment.MethodsThe antimicrobial effect of Erythromycin Ointment was determined by recovery rate with 5 control strains.ResultsAccording to theResultsof the recovery rate test.Erythromycin Ointment had higher antimicrobial effects.ConclusionThe antimicrobial effect must be eliminated by centrifugation and membrane filtration.The method can be used to the microbial limit test for Erythromycin Ointment.

Erythromycin Ointment;microbial limit;Recovery rate根據(jù)2005年版中國(guó)藥典規(guī)定微生物限度檢查應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證。紅霉素屬于大環(huán)內(nèi)酯類的抗生素，對(duì)革蘭氏陽性微生物

246001安慶市食品藥品檢驗(yàn)所

·論著·