侯志強(qiáng)，王薇，張晶，許永根，周臻，黃琛，2

（北京大學(xué)第三醫(yī)院 1.眼科；2.中心實驗室，北京 100191）

顆粒狀角膜營養(yǎng)不良一家系BIGH3基因突變的研究

侯志強(qiáng)1，王薇1，張晶1，許永根1，周臻1，黃琛1，2

（北京大學(xué)第三醫(yī)院 1.眼科；2.中心實驗室，北京 100191）

目的對1個顆粒狀角膜營養(yǎng)不良家系進(jìn)行分子遺傳學(xué)分析，探討其BIGH3基因突變的類型。方法 收集1個顆粒狀角膜營養(yǎng)不良家系中2名患者和1名正常成員的外周血5ml，提取白細(xì)胞DNA，利用合成的BIGH3基因第4、11和12外顯子的特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對PCR產(chǎn)物直接行DNA測序分析。結(jié)果 該家系患者成員的BIGH3基因第4外顯子存在CGC>CAC（R124H）突變雜合子，而家系表現(xiàn)正常成員無此基因位點突變。結(jié)論該顆粒狀角膜營養(yǎng)不良家系存在BIGH3基因突變，為R124H雜合突變類型，確診為Avellino角膜營養(yǎng)不良。

角膜營養(yǎng)不良；BIGH3基因；突變；雜合子

角膜營養(yǎng)不良是一組與遺傳有關(guān)的原發(fā)性、具有病理學(xué)組織特性的疾病。裂隙燈下可見角膜前彈力層下面包屑樣混濁，隨著年齡增長混濁可變?yōu)楸P狀，混濁間及角膜周邊部保持清亮［1］。隨著分子遺傳學(xué)研究的深入，已發(fā)現(xiàn)該病有關(guān)的多個致病基因［2，3］，其中，BIGH3基因突變與多種類型的角膜營養(yǎng)不良有關(guān)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，顆粒狀角膜營養(yǎng)不良（granular corneal dystrophy，GCD）Ⅰ型中 BIGH3基因突變位點為 R555W［4］，GCDⅡ型（即 Avellino角膜營養(yǎng)不良）為 R124H［5，6］，GCD Ⅲ型為 R124L［7］、R555Q［4］和 G623D［8］，均為常染色體顯性遺傳。本研究對 1個GCD家系進(jìn)行了分子遺傳學(xué)研究，并對該家系中的2名患者和1名正常成員進(jìn)行了系統(tǒng)的臨床和基因分析，以明確該家系是否存在BIGH3基因突變及突變類型，旨在探討分子遺傳學(xué)在角膜營養(yǎng)不良臨床診斷中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

對1個GCD家系中2名患者和1名正常成員進(jìn)行分析。該家系來自北京大學(xué)第三醫(yī)院眼科，2代3人，其中患病者2人，均為男性。詳細(xì)詢問病史、行裂隙燈顯微鏡檢查及眼前段照相。

該GCD家系呈常染色體顯性遺傳，其家系譜見圖1。家系中2例患者中先證者表現(xiàn)為雙眼對稱性中央部角膜基質(zhì)層散在大量的環(huán)狀、盤狀、星狀和不規(guī)則形狀的混濁，邊緣清晰，同時混濁間角膜和周邊部角膜透明。而患者I-1右眼角膜清亮無混濁，左眼僅見下方角膜1個斑點狀混濁，邊界清晰。角膜混濁形態(tài)見圖2。

1.2 BIGH3基因突變檢測

1.2.1 試劑和儀器：血液基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，PCR Master Mix（2X）購自 Fermentas公司，DL2000TMDNA Marker購自大連寶生物公司，UltraPureTMAgarose和Ultra－PureTMDNA Typing Grade誖 50X TAE Buffer購自 In－vitrogen公司。

1.2.2 基因組DNA提?。涸讷@得被采血人書面簽字同意后，抽取2名患者和1名家系正常成員的外周血5ml，置于EDTA-K3抗凝的真空采血管中，按血液基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA。

1.2.3 聚合酶鏈反應(yīng) （polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增：合成BIGH3基因第4，11和12外顯子PCR特異性引物各1對（北京擎科生物技術(shù)有限公司），引物序列、解鏈溫度（Tm）和PCR產(chǎn)物片段長度見表1。采用PCR Master Mix（2X）進(jìn)行BIGH3基因第4、11和12外顯子序列PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94℃ 5min；94℃ 30s，Tm 45s，72℃ 1min20s，30個循環(huán)；72℃10min。

1.2.5 PCR產(chǎn)物測序：PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測特異性后，送北京擎科生物技術(shù)有限公司，應(yīng)用ABI377自動測序儀進(jìn)行測序。

2 結(jié)果

該GCD家系的全部患者均擴(kuò)增出特異性條帶。第4，11和12外顯子PCR產(chǎn)物長度分別為442bp，374bp，475bp。所有PCR產(chǎn)物均進(jìn)行正反雙向測序，反向序列結(jié)果與正向序列結(jié)果相符，再將DNA測序結(jié)果與GenBank中BIGH3基因原始序列進(jìn)行序列比對，結(jié)果如下：

表1 BIGH3基因第4、11和12外顯子PCR特異性引物信息及產(chǎn)物長度Tab.1 Primers and product length of exons 4，11，and 12ofBIGH3gene Exon Primer sequence Tm（℃） PCR product（bp）4 F 5′-CCTCTCCACCTGTAGATGTACC-3′ 52 442R 5′-GACGCAACCTGGTAAGACAT-3′11 F 5′-CCTCGTGGAAGTATAACCAGTC-3′ 51 374R 5′-CCAATGTAAGCTTTCAAGGC-3′12 F 5′-GAGAGCTGGAGCCTGGAATC-3′ 56 475R 5′-GCTAGTTCCTTTAGTCCCGCC-3′Tm，melting temperature.

2.1 R124H（CGC>CAC）突變

BIGH3基因第4外顯子編碼區(qū)段的124密碼子的正常序列為純合CGC（圖3A），編碼精氨酸。如圖3B和表2所示，該家系2名患者均檢測到基因突變，為R124H突變雜合子（CGC>CAC），編碼組氨酸，其外顯率為100%。而正常成員無該位點突變。

2.2 同義單核苷酸多態(tài)性 （single nucleotide polymorphism，SNP）

BIGH3基因第11外顯子編碼區(qū)段的472密碼子的正常序列為CTC（圖3C），可存在CTT的SNP，編碼亮氨酸?；颊叽嬖贑TC>CTT的同義SNP（圖3D，表2），為雜合型。正常成員無該位點同義SNP存在。BIGH3基因第12外顯子編碼區(qū)段的540密碼子的正常序列為TTT（圖3E），可存在TTC的同義SNP，編碼苯丙氨酸?；颊撷?1和Ⅱ-1存在TTT>TTC的SNP（圖3F，表2），為雜合型。家系正常成員I-2無該位點同義SNP。

表2 顆粒狀角膜營養(yǎng)不良家系的BIGH3基因突變和同義SNP Tab.2 Mutation and SNP ofBIGH3gene in a family with granular corneal dystrophy BIGH3gene mutation and SNP R124H（CGC>CAC） L472L（CTC>CTT） F540F（TTT>TTC）Ⅰ-1 ＋ ＋ ＋Ⅰ-2* － － －Ⅱ-1 ＋ ＋ ＋*normal phenotype；＋，presence；－，absence.Patient No.

2.3 以分子遺傳學(xué)為基礎(chǔ)的臨床診斷

對照各類GCD所存在的BIGH3基因突變類型，診斷該家系應(yīng)為Avellino角膜營養(yǎng)不良。

3 討論

GCD作為最常見的一種角膜實質(zhì)部營養(yǎng)不良，臨床上分為 3型［1］：GCD I型：兒童期發(fā)病，裂隙燈檢查發(fā)現(xiàn)在前彈力層下有呈面包屑樣混濁，隨著年齡增長，混濁可以擴(kuò)大為盤狀，但混濁間及角膜周邊部保持清亮。電鏡下可見細(xì)胞外的沉積物富含蛋白質(zhì)；GCDⅡ型：即Avellino角膜營養(yǎng)不良，裂隙燈下可見角膜基質(zhì)內(nèi)環(huán)狀、盤狀、星形、雪花狀混濁。病理檢查發(fā)現(xiàn)，角膜基質(zhì)中有圓點狀結(jié)晶體聚集，并有淀粉樣物質(zhì)存在；GCDⅢ型：即Reis-bucklers角膜營養(yǎng)不良、Bowman層營養(yǎng)不良型、地圖狀角膜營養(yǎng)不良。其典型臨床表現(xiàn)為混濁僅限于上皮層或上皮下，圓點狀混濁位于前彈力層和上皮下，位置表淺的環(huán)形和盤狀混濁，逐漸發(fā)展為中央環(huán)形或地圖狀，有時在深部基質(zhì)可存在衛(wèi)星灶。裂隙燈檢查提示本研究中的角膜營養(yǎng)不良患者的角膜混濁部位及形態(tài)符合顆粒狀角膜營養(yǎng)不良。但患者Ⅰ-1的右眼未見有混濁病灶，同時其左眼也僅有1個斑點狀混濁病灶?；鞚釃?yán)重程度明顯小于患者Ⅱ-1。

BIGH3基因是第一個被確定的角膜營養(yǎng)不良的致病基因，其編碼的KE蛋白包含1個氨基端的分泌性前導(dǎo)肽信號序列，1個羧基末端的RGD序列（Arg-Gly-Asp）和中間4個由140個氨基酸組成的內(nèi)部重復(fù)同源序列（fasc1～4）。近年的研究結(jié)果顯示，該致病基因主要影響KE蛋白的氨基酸R124和fasc-4區(qū)域［4］。本研究發(fā)現(xiàn)，該角膜營養(yǎng)不良家系中患者的BIGH3基因突變類型為R124H雜合突變，而家系中正常表型成員不存在該位點突變。根據(jù)遺傳學(xué)研究結(jié)果，可將本家系角膜營養(yǎng)不良確診為Avellino角膜營養(yǎng)不良（即GCDⅡ型），其致病的突變位點為BIGH3基因的R124H。

本研究還發(fā)現(xiàn)，該家系成員中存在兩個位點的同義SNP，即第11外顯子編碼區(qū)段的472密碼子CTC>CTT和第12外顯子編碼區(qū)段的540密碼子TTT>TTC。同義SNP所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同，因此對KE蛋白的表達(dá)和功能無影響。提示該家系主要致病因素為BIGH3基因的R124H雜合突變。

BIGH3基因相關(guān)性角膜營養(yǎng)不良表現(xiàn)為發(fā)病年齡越早，病情越嚴(yán)重，其嚴(yán)重程度與突變基因的純合或雜合狀態(tài)有關(guān)［9］。純合子患者臨床特點包括：（1）近親婚配的后代；（2）發(fā)病早，進(jìn)展快，早期接受角膜移植手術(shù)；（3）術(shù)后1年內(nèi)復(fù)發(fā)；（4）角膜沉積物數(shù)量多于雜合子。本研究中患者I-1的右眼未見有混濁病灶，同時其左眼也僅有1個斑點狀混濁病灶?；颊撷?1的角膜混濁嚴(yán)重程度也很輕。該家系的分子遺傳學(xué)檢測提示為BIGH3基因的R124H雜合突變，提示突變基因?qū)Ρ憩F(xiàn)型嚴(yán)重程度的影響具有劑量效應(yīng)。

總之，分子遺傳學(xué)研究為臨床提供了新的分類分型方法，應(yīng)用該方法對角膜營養(yǎng)不良進(jìn)行分類和分型，使臨床診斷的準(zhǔn)確性得到極大的提高，擁有傳統(tǒng)的眼科常規(guī)檢查法所不可比擬的優(yōu)勢。同時，也使遺傳咨詢成為可能，為最終實現(xiàn)角膜營養(yǎng)不良的基因治療提供基礎(chǔ)。

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（編輯王又冬，英文編輯陳 姜）

Analysis ofBIGH3Gene Mutation in a Chinese Family with Granular Corneal Dystrophy

HOU Zhi-qiang1，WANG Wei1，ZHANG Jing1，XU Yong-gen1，ZHOU Zhen1，HUANG Chen1，2
（1.Department of Ophthalmology；2.Central Laboratory，Peking University Third Hospital，Beijing 100191，China）

ObjectiveTo detect the mutation ofBIGH3gene in a Chinese family with granular corneal dystrophy and identify the type of mutation.MethodsPeripheral blood was sampled from 2patients and 1unaffected family member from a family with corneal dystrophy.DNA in the leukocytes was extracted.Exons 4，11，and 12ofBIGH3gene were amplified by polymerase chain reaction，and the products were sequenced directly.ResultsDirect sequencing of all affected members revealed a G to A transition at codon 124（CGC to CAC），resulting in R124H mutation ofBIGH3gene.ConclusionR124H mutation ofBIGH3gene is detected in a Chinese family with granular corneal dystrophy，and the definite diagnosis is Avellino corneal dystrophy.

corneal dystrophies；BIGH3gene；mutation；heterozygote

R772.2

A

0258-4646（2011）03-0246-04

doiCNKI：21-1227/R.20110328.1517.017

北京市科學(xué)技術(shù)委員會資助項目（D206009000091）

侯志強(qiáng)（1973-），男，主治醫(yī)師，博士.

黃琛，E-mail：candyhuang719@hotmail.com

2010-12-24