申繼清，王啟輝，葉潔梅，王 健，冷 靜*

(1廣西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，南寧530021;2廣西壯族自治區(qū)疾病預防控制中心; 3廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院)

狂犬病是迄今為止人類致死率最高的可防不可治的急性傳染病，預防與控制的惟一有效措施是接種狂犬病疫苗。目前使用的狂犬病疫苗大多為液體(含鋁佐劑)和凍干(無佐劑)的純化Vero細胞疫苗，其中鋁佐劑可導致機體產(chǎn)生抗體遲緩、細胞免疫抑制，且液體疫苗穩(wěn)定性差［1］;而凍干純化Vero細胞疫苗雖然純度高、穩(wěn)定性好、毒副反應少、免疫后抗體陽轉率較高，但需免疫5次、疫苗免疫原性低，且單獨用疫苗接種后抗體產(chǎn)生較遲、維持時間短［2］。冷靜等［3，4］、Leng等［5］及王健等［6］研究顯示，成團泛菌脂多糖(LPSp)對乙肝表面抗原及純狂犬病毒蛋白疫苗均有明顯佐劑效應，且安全、活性高，但對含鋁佐劑狂犬病疫苗佐劑效應不明顯。2009年7月，我們觀察了LPSp對小鼠不同免疫方案中狂犬病毒抗原免疫效果的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雌性Balb/c小鼠128只，6～8周齡，體質量18～23 g(廣西醫(yī)科大學實驗動物中心);LPSp，質量濃度為2 mg/ml;狂犬病疫苗(含氫氧化鋁)，本教研室自制，抗原含量為2.5 IU/ml;狂犬病毒蛋白，抗原含量為2.5 IU/ml;羊抗小鼠IgG單克隆抗體，AP標記;羊抗小鼠IgM單克隆抗體，AP標記;抗狂犬病毒標準陽性血清。

1.2 動物分組及處理 將120只Balb/c小鼠隨機分為空白組、LPSp對照組、鋁佐劑疫苗組、狂犬病毒蛋白組、LPSp實驗組各24只，其中后四組分別背部注射LPSp、鋁佐劑疫苗、狂犬病毒蛋白及狂犬病毒蛋白+LPSp進行1(第0天)、2(第0、15天)、4次(第0、7、15、21天)免疫(各8只)，狂犬病毒蛋白用量均為每只0.5 IU、LPSp用量為每只10 μg，用時以生理鹽水配制為0.2 ml;空白組注射等量生理鹽水。另取8只小鼠為常規(guī)組，按鋁佐劑疫苗組免疫4次，并于第28天行第5次免疫。

1.3 血清抗狂犬病毒抗體檢測 各組分別在初次免疫后第7、14、21、30、45、60天經(jīng)眼內眥靜脈取血，分離血清，采用間接ELISA法檢測血清抗狂犬病毒抗體。以未免疫小鼠血清作為陰性對照，以10 μg/ml純狂犬病毒蛋白包被96孔酶標板，4℃過夜，洗滌后用0.2%Gelatin于37℃溫箱封閉2 h，洗滌后加入倍比稀釋的待檢血清，每孔50 μl，設陽性對照、陰性對照和空白對照，37℃溫育1 h;洗滌后加AP標記的羊抗小鼠1 g，每孔50 μl(空白對照不加)，37℃溫育1 h，充分洗滌后每孔加100 μl p-NPP底物反應液，37℃避光顯色30 min，每孔加2 N NaOH溶液50 μl終止反應，在酶標儀上讀取每孔OD405值?？贵w最高稀釋度計算以檢測值/陰性對照值(P/N)≥2.1判定，實驗測定值取組內小鼠測定值的幾何平均值。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學處理。計量數(shù)據(jù)經(jīng)變量轉換(取對數(shù))后以ˉx ±s表示，兩兩比較采用方差分析，檢驗水準α= 0.05。

2 結果

2.1 抗狂犬病毒IgG抗體滴度 空白組和LPS對照組不同時間抗狂犬病毒IgG抗體滴度均＜2;其余四組不同時間抗狂犬病毒IgG抗體滴度見表1。

2.2 抗狂犬病毒IgM抗體滴度 LPSp實驗組在一次免疫后第7天IgM抗體滴度顯著高于狂犬病毒蛋白組與鋁佐劑疫苗組(P均＜0.05)，第7天后IgM抗體滴度下降，但2、4次免疫時又出現(xiàn)以上趨勢。

表1 四組不同時間抗狂犬病毒IgG抗體滴度(n=8，±s)

表1 四組不同時間抗狂犬病毒IgG抗體滴度(n=8，±s)

注:與同免疫次數(shù)、同時間狂犬病毒蛋白組及鋁佐劑疫苗組比較，*P＜0.05;與本組同時間免疫1次者比較，#P＜0.05，與免疫2次者比較，ΔP＜0.05;與同時間LPSp實驗組、狂犬病毒蛋白組免疫4次者比較，▽P＜0.05;與同時間狂犬病毒蛋白組免疫2次者比較，▲P＜0.05

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3 討論

研究顯示，隨狂犬病毒血清型變異及養(yǎng)犬熱日益升溫［7，8］，狂犬病發(fā)病率呈上升趨勢。由于疫苗接種的依從性是影響免疫接種成功與否的關鍵因素之一，開發(fā)高效、安全、廉價、免疫程序短的新型狂犬病疫苗及新型疫苗佐劑已成為日前狂犬病疫苗研究領域中的重要內容。LPSp對細胞免疫及體液免疫均有輔佐作用，可增強多糖抗原及蛋白抗原的免疫反應;其在體內不易降解，對腫瘤、潰瘍、燒傷、皰疹等多種疾病有肯定療效。

本研究顯示，免疫2、4次后LPSp實驗組抗狂犬病毒IgG抗體滴度均顯著高于狂犬病毒蛋白組和鋁佐劑疫苗組，且4次免疫后抗體滴度在第60天仍呈上升趨勢(抗體至少維持在8周以上)，而鋁佐劑疫苗組IgG抗體滴度在45 d已達高峰，其后逐漸下降;各組免疫1、2次者免疫效果均欠佳。提示4次免疫后LPSp能持續(xù)刺激高滴度抗狂犬病毒IgG抗體產(chǎn)生，且使抗體維持更長時間;狂犬病蛋白疫苗免疫原性較弱。本研究還顯示，LPSp實驗組免疫4次者各個時間點IgG抗體滴度均顯著高于常規(guī)組，且可維持更長時間;LPSp實驗組免疫2次者IgG抗體滴度與鋁佐劑疫苗組免疫4次者效果相當。提示LPSp佐劑疫苗的免疫效果優(yōu)于鋁佐劑疫苗，有望減少免疫次數(shù)、提高疫苗接種依從性。

此外，本研究還顯示，LPSp實驗組在第1次免疫后第7天IgM抗體滴度顯著高于狂犬病毒蛋白組與鋁佐劑疫苗組，第7天后IgM抗體滴度下降，但再次免疫時又出現(xiàn)以上趨勢;免疫2次后LPSp實驗組IgG抗體滴度達高峰時間顯著早于狂犬病毒蛋白組和鋁佐劑疫苗組。提示LPSp能顯著增強IgM抗體產(chǎn)生;LPSp可能促進狂犬病疫苗免疫后的早期保護效果。

綜上所述，LPSp作為狂犬病毒蛋白疫苗的佐劑可顯著提高小鼠產(chǎn)生抗狂犬病毒IgG、IgM抗體的滴度，且可延長抗體的維持時間、減少接種次數(shù)，其效果優(yōu)于鋁佐劑。

［1］林海祥，Perrin P.鋁佐劑對實驗狂犬病疫苗的影響［J］.中華實驗和臨床病毒學雜志，1999，13(2):133-135.

［2］余光開，彭建一.狂犬病免疫程序研究［J］.中國人獸共患病雜志，1995，11(4):50-51.

［3］冷靜，葉峻，黎肇炎，等.成團泛菌低分子脂多糖的分離純化和鑒定［J］.廣西醫(yī)科大學學報，2003，20(6):840-842.

［4］冷靜，韋錦斌.成團泛菌低分子脂多糖的遺傳毒性研究［J］.廣西醫(yī)科大學學報，2007，24(5):676-677.

［5］Leng J，Wang QH，Wang J，et al.The regulatory effect of LPSp on hepatitis B surface antibody［J］.Chin J Chro Dis，2004，3(4):84-88.

［6］王健，冷靜，王啟輝.LPSp輔佐HBsAg誘導機體產(chǎn)生特異性抗體的機制［J］.細胞與分子免疫學雜志，2007，23(6):559-561.

［7］李浩，陶曉燕，宋淼，等.狂犬病高發(fā)地區(qū)犬只感染情況調查分析［J］.中華實驗和臨床病毒學雜志，2008，22(3):161-164.

［8］梁炯明，盧耀娟，胡昱，等.玉林市10年狂犬病流行病學分析［J］.中國公共衛(wèi)生管理，2009，25(2):177-178.