耿國軍 姜杰 杜好信 錢文軒 張義 楊麗華 陳端揚 陳雋鵬

（1福建省廈門市中醫(yī)院 廈門 361000；2廈門大學醫(yī)學院 福建廈門 361009）

黃芪對肺腺癌細胞生長抑制的實驗研究*

耿國軍1姜杰1杜好信1錢文軒1張義1楊麗華2陳端揚1陳雋鵬1

（1福建省廈門市中醫(yī)院 廈門 361000；2廈門大學醫(yī)學院 福建廈門 361009）

目的：研究分化誘導劑黃芪(Astragalus)在體外對人肺腺癌SPC-A-1細胞生長抑制的影響。方法：用不同濃度的黃芪分別處理肺腺癌SPC-A-1細胞后，鏡下觀察癌細胞的生長情況；測定軟瓊脂克隆形成率；MTT(噻唑藍)法測定生長抑制率。結(jié)果：不同濃度黃芪處理后細胞的生長明顯受到抑制，細胞生長抑制率隨黃芪的濃度增加而增加。結(jié)論：黃芪對肺腺癌SPC-A-1細胞的生長有明顯的抑制作用。

黃芪；肺腺癌；SPC-A-1；MTT法；生長抑制

近年研究表明，黃芪具有提高免疫、增強造血、增強細胞代謝、清除自由基、抗腫瘤免疫應答等作用[1]。為探討黃芪對肺腺癌細胞的生長抑制作用，本研究選擇肺腺癌細胞進行體外實驗，通過一定濃度的黃芪處理肺腺癌細胞一定時間后，觀察其對肺腺癌細胞的生長抑制效果，為臨床治療肺癌提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 黃芪購自浙江杭州，配制為20 g/L的無菌溶液備用。流式細胞儀，為美國產(chǎn)品。SPC-A-1細胞株為廈門大學生命科學學院提供。小牛血清購自上海江萊生物科技有限公司，實驗時選用對數(shù)生長期細胞。

1.2 細胞培養(yǎng)觀察增殖力 隨機取5瓶處于對數(shù)生長期的SPC-A-1細胞，在其中的4瓶內(nèi)加入不同濃度的黃芪（0.25、0.50、0.75、1.00 mg/mL）。及時更換新鮮培養(yǎng)基，同時保持藥物濃度不變，連續(xù)培養(yǎng)，觀察細胞增殖情況。剩余的1瓶正常培養(yǎng)做對照。

1.3 軟瓊脂克隆形成測定 參照鄂征[2]報道的方法，黃芪的濃度分別為 0、0.25、0.50、0.75、1.00 mg/mL，連續(xù)培養(yǎng)2周，計算克隆形成率與克隆抑制率?？寺⌒纬陕?克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%；克隆抑制率=(1－實驗組克隆數(shù)/對照組克隆數(shù))× 100%。

1.4 MTT法 檢測細胞生長抑制率。參照司徒鎮(zhèn)強[3]方法，調(diào)整細胞濃度至103～104/mL，并使細胞分散良好；將稀釋的細胞懸液加到96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔200 μL。4～5 h細胞貼壁后，加入不同濃度的黃芪，使不同組的終濃度分別為 0.25、0.50、0.75、1.00 mg/mL，對照組加等量的培養(yǎng)基，微型震蕩器震蕩后，用酶標儀于波長492 nm處測吸光度值(OD)，計算抑制率。

1.5 統(tǒng)計學分析 全部數(shù)據(jù)以(±S)表示，顯著性比較用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的黃芪對SPC-A-1細胞生長的影響黃芪對SPC-A-1細胞24 h顯示出生長抑制作用，48 h和72 h抑制作用較明顯。0.25、0.50、0.75、1.00 mg/mL黃芪對SPC-A-1均可抑制細胞增殖，且隨濃度增加對SPC-A-1的抑制率也增加，不同濃度組間有統(tǒng)計學意義；而且同一濃度黃芪對SPC-A-1的抑制率隨時間延長而增加，不同時間組間有統(tǒng)計學意義。結(jié)果見表1。

表1 黃芪對SPC-A-1細胞增殖的影響 (±S)%

表1 黃芪對SPC-A-1細胞增殖的影響 (±S)%

黃芪(mg/mL) 24h抑制率 48h抑制率 72h抑制率 P值0.25組 2.25±1.16 4.53±1.13 9.63±1.35 ＜0.01 0.50組 4.18±1.13 9.65±1.31 15.38±1.43 ＜0.01 0.75組 7.66±1.27 16.28±1.53 23.26±1.23 ＜0.01 1.00組 12.53±0.36 21.73±1.21 29.65±1.08 ＜0.01 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 不同濃度的黃芪對SPC-A-1細胞軟瓊脂克隆形成能力的影響 隨黃芪濃度增加，其克隆形成率逐漸下降，克隆抑制率逐漸上升，增殖抑制更加明顯。結(jié)果見表2。

表2 SPC-A-1細胞克隆形成率及抑制率 (±S)%

表2 SPC-A-1細胞克隆形成率及抑制率 (±S)%

黃芪(mg/mL) 克隆形成率 克隆抑制率0.00組 16.1±1.68 -0.25組 11.7±1.36 12.3 0.50組 8.56±1.13 53.6 0.75組 5.65±1.22 65.0 1.00組 2.13±0.86 81.6

2.3 不同濃度的黃芪對SPC-A-1細胞作用24 h后吸光度值 吸光度值逐漸下降，其生長抑制率逐漸增加。結(jié)果見表3。

表3 SPC-A-1細胞的生長抑制率 (±S) %

表3 SPC-A-1細胞的生長抑制率 (±S) %

黃芪(mg/mL) OD 生長抑制率0.00組 0.313±0.0251 -0.25組 0.295±0.0212 8.5 0.50組 0.275±0.0193 16.1 0.75組 0.246±0.0211 23.0 1.00組 0.223±0.0213 35.6

3 討論

肺癌是目前發(fā)病率和死亡率增長最快、對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤。由于其具體發(fā)病機制仍然不十分清楚，以手術(shù)、化療、放療為主的綜合治療手段仍不盡人意，肺癌的預后仍較差[4]。中藥作為生物調(diào)節(jié)劑，具有長效、持久、副作用少的特點，容易為廣大患者所接受，可能會成為腫瘤治療的一條新途徑?，F(xiàn)代藥理學研究證實，黃芪、氧化黃芪等生物堿成分具有提高免疫、增強造血、增強細胞代謝、清除自由基、抗腫瘤免疫應答等多方面生物活性而備受關(guān)注[5～6]。肺癌的高侵襲及轉(zhuǎn)移的生物學特性多年來一直困擾著臨床治療工作，尋找新的治療方法和有效抗癌藥物具有相當重要的意義。

近年來，隨著惡性腫瘤的誘導分化療法的日益興起，黃芪作為一種具有臨床應用價值的誘導分化劑引起研究者越來越多的關(guān)注和興趣。細胞持續(xù)分裂和不斷增殖是腫瘤區(qū)別于正常細胞的一個重要特征，因此，觀察對腫瘤細胞的增殖活性的抑制作用是篩選誘導分化劑的基本指標。在本研究中，我們通過較長時間的觀察SPC-A-1細胞的擴增傳代發(fā)現(xiàn)：在黃芪的作用下，SPC-A-1細胞增殖減慢，隨黃芪濃度增加，其增殖抑制更加明顯，最后停止生長。雖然其中可能發(fā)生細胞的凋亡或死亡，但細胞增殖抑制是肯定的。軟瓊脂克隆形成實驗及MTT法是測定單個細胞增殖能力及檢測細胞存活和生長的有效方法[6]，為進一步證實黃芪對SPC-A-1細胞的抑制作用，我們應用軟瓊脂克隆形成實驗及MTT法。結(jié)果表明，除0.25 mg/mL組外，其余各組與對照組相比，均有顯著性差異（P＜0.01），且隨著藥物濃度的增加，其生長抑制率及克隆抑制率明顯增高。這與其他的研究報道[7～9]一致。

綜上結(jié)果分析，一定濃度的黃芪能有效地抑制SPC-A-1細胞的生長增殖，并且隨濃度的增加其抑制作用明顯增加。其作用機制可能與黃芪調(diào)控SPC-A-1細胞的凋亡有關(guān)，不是單純的細胞毒性壞死[10]。隨著分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是基因芯片和蛋白芯片技術(shù)的發(fā)展,必將對黃芪類抗腫瘤機制[12]的研究起到很大的推動作用，而針對這些機制的研究定會開發(fā)出新型的與黃芪類抗腫瘤作用同一分子靶點的藥物，這將為腫瘤的治療開辟一條新途徑。

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[3]司徒鎮(zhèn)強.細胞培養(yǎng)[M].西安：興國圖書出版公司,2001.186

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Objective:To study the activity of the growth suppression effects with Astragalus on SPC-A-1 human lung adenocarcinoma cel1.Methods:Different concentrations of Astragalus were used in the culture of SPC-A-1 cells.Determination of clone forming ability on soft agar and growth suppression effects with Astragalus were measured by a tetrazolium-based volorimetric assay (MTT assay).Results:Proliferation of SPC-A-1 cells was inhibited effectively after being treated by different concentrations of Astragalus, the rate of growth suppression was increasing with increased concentration of Astragalus.Conclusion:Astragalus have the significant effect on inhibiting on SPC-A-1 human lung adenocarcinoma cel1.

Astragalus;Lung adenocarcinoma cel1;SPC-A-1;Thiazolyl blue;Growth suppression

R 285.5

B

10.3969/j.issn.1671-4040.2011.01.002

*福建省自然科學基金項目：閩科計[2008]59號文

2010-09-06）