趙偉光,謝延平,閆亮,胡志恒,王浩,林欣

骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4基因單核苷酸多態(tài)性與頸椎后縱韌帶骨化癥

趙偉光,謝延平,閆亮,胡志恒,王浩,林欣

目的探討骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4(BMP-4)單核苷酸多態(tài)性與頸椎后縱韌帶骨化(OPLL)的遺傳關(guān)聯(lián)性。方法OPLL病例組和正常對照組各200例,利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和直接測序法分析BMP-4上4個單核苷酸多態(tài)性位點6007C＞T(rs17563),-5826G＞A(rs1957860),3564C＞T(rs2855532)和IVS-160C＞T(rs2071047)基因型及等位基因的分布。結(jié)果兩組間位點rs17563、rs2855532基因型與等位基因型有顯著性差異(P＜0.05)。病例組中 rs17563帶C+基因型與 C-基因型骨化椎體數(shù)量有非常高度顯著性差異(P＜0.001),前者骨化椎體數(shù)量明顯少于后者;rs2855532 T+基因型與T-基因型骨化椎體數(shù)量有顯著性差異(P＜0.05),前者骨化椎體數(shù)量多于后者。余兩位點無顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)論BMP-4基因的兩個單核酸多態(tài)性位點rs17563、rs2855532等位基因型突變與OPLL的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。

后縱韌帶骨化癥;骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4;基因;單核苷酸多態(tài)性

頸椎后縱韌帶骨化癥是指因頸椎的后縱韌帶發(fā)生骨化,從而壓迫相應(yīng)節(jié)段的脊髓和(或)神經(jīng)根,產(chǎn)生肢體的感覺和運動障礙及內(nèi)臟自主神經(jīng)功能紊亂的一種疾病。保守治療不能阻止本病的發(fā)展。目前其發(fā)病機制還未完全明了,大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為與遺傳及外界損傷等多重因素有關(guān),其中遺傳背景在本病的發(fā)生和發(fā)展中起主要作用。已報道一些因子與OPLL高度相關(guān),如轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4(BMP-4)等。其中對骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4報道較少。本文研究BMP-4基因上4個單核苷酸多態(tài)性位點6007C＞T(rs17563)、-5826G＞A(rs1957860)、3564C＞T(rs2855532)和 IVS-160C＞T(rs2071047)與頸椎后縱韌帶骨化癥的關(guān)聯(lián)性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 實驗樣本 由骨科專家組根據(jù)Tsuyama的臨床診斷[1]標(biāo)準(zhǔn)將樣本分為OPLL病例組和對照組。病例組:男性 117例,女性83例,年齡 42～71歲,平均56.7歲;對照組:男性122例,女性78例,年齡47歲～68歲,平均 55.4歲。收集每位參與者周圍靜脈血4 ml,EDTA K2抗凝。對樣本進行隨機混合編號。

1.1.2 主要儀器及試劑 Wizard Genomic DNA Purification Kit:美國 Promega公司;dNTP及耐熱性DNA酶:日本TaKaRa公司;引物由北京三博遠(yuǎn)志生物有限責(zé)任公司合成。ABI 3730XL DNA測序儀、PCR儀MYCYCLER:美國BIO-RaD公司;SIGMA低溫高速離心機、凝膠成像系統(tǒng)Biospectrum。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA的提取 利用DNA提取試劑盒進行人血白細(xì)胞基因組DNA提取。提取的DNA樣品經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳測定,A260/A280紫外定量,確定每個樣本已提取DNA成功。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及產(chǎn)物序列測定 利用PCR儀,50 μ l反應(yīng)體系對目的DNA片段進行體外擴增 :10 ×LA PCR Buffer 5 μ l+Mg+(25 mmol/L)5 μ l+dNTPs Mixture(25 mmol/L)8 μ l+上游引物(10 μ mol/L)1 μ l+下游引物(10 μ mol/L)1 μ l+Tap 酶(5 U/μ l)0.5 μ l+模板 2.5 μ l,最后加滅菌蒸餾水至50 μ l。反應(yīng)條件及引物見表1。對產(chǎn)物純化后用直接測序法測定序列。

表1 SNP位點及其引物、擴增片段的長度

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 利用SPSS 13.0軟件對病例組與對照組基因型、等位基因型分布進行χ2檢驗。不同基因型與骨化程度之間的關(guān)系采用非參數(shù)檢驗(Mann-Whitney法)。

2 結(jié)果

位點6007C＞T(rs17563)、3564C＞T(rs2855532)基因型、等位基因在兩組間的分布有顯著性差異(P＜0.05);而其余兩個位點無顯著性差異(P＞0.05)。見表 2、表 3 。

表2 兩組間各位點基因型的分布比較

表3 兩組間rs17563、rs2855532位點等位基因的分布比較

無顯著性差異的兩個位點 rs2071047、rs1957860在分性別比較后,兩組同性別之間基因型的分布仍無顯著性差異。見表4、表5。

表4 兩組間不同性別rs2071047位點基因型的分布比較

表5 兩組間不同性別rs1957860位點基因型的分布比較

病例組中,rs17563基因型為TT的患者骨化椎體數(shù)量顯著多于基因型為TC或CC患者(P＜0.001,圖1);rs2855532基因型為TT或CT的患者骨化椎體數(shù)量多于基因型為CC的患者(P＜0.05,圖2);其余兩個位點比較無顯著性差異(P＞0.05)。

3 討論

已有實驗證明頸椎后縱韌帶骨化癥具有強大的遺傳背景。Taizo等進行的一項大樣本病例對照研究(711例OPLL患者和896名對照)發(fā)現(xiàn),TGF-β3基因的單核苷酸多態(tài)性與OPLL的發(fā)生具有顯著相關(guān)性(P=0.00040)[2]。

免疫組織病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),在OPLL患者骨化的后縱韌帶中,BMP-4、BMP-2、TGF-β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體(BMPRs)和活化素受體(ActRs)等都有異常過量的表達。BMPs是一族獨特的糖蛋白,是目前發(fā)現(xiàn)的惟一具有誘導(dǎo)誘導(dǎo)性成骨祖細(xì)胞(inducible osteogenic precursor cells,IOPC)類細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化的蛋白質(zhì)。BMPs由一個結(jié)構(gòu)和功能相似的多肽因子家族組成,除了BMP-1都屬于 TGF-β超家族的成員。BMPs家族迄今已發(fā)現(xiàn)20多種蛋白,根據(jù)同源性可分為以下4個亞族:①BMP-2/BMP-4;②BMP-3;③OP-1/BMP-7;④GDF-5,6,7?；蜻B鎖分析研究表明,調(diào)節(jié)骨形成、骨量及其微觀結(jié)構(gòu)的基因定位于染色體14q12-23[3-4],其中BMP-4基因位于14q22-23;它除了具有強大的誘導(dǎo)成骨能力外,還通過BMP-Smads及MAPK的級聯(lián)激活途徑等廣泛參與包括心血管、胃腸、呼吸、泌尿、生殖及神經(jīng)系統(tǒng)的胚胎發(fā)育、生長和分化[5-7]。BMP-4與BMP-2高度形似,均可在體內(nèi)外誘導(dǎo)骨和軟骨形成[8]。Sato等進行的免疫組織化學(xué)研究表明,BMP-4、BMP-2在后縱韌帶骨化灶表面肥大化生的軟骨細(xì)胞內(nèi)高表達[9]。已有文獻報道BMP-2單核苷酸多態(tài)性與頸椎后縱韌帶骨化癥有關(guān)[10]。

本實驗選定的 4個 SNP位點 6007C＞T(rs17563)、3564C ＞T(rs2855532)、IVS-160C ＞T(rs2071047)、-5826G＞A(rs1957860)分別位于BMP-4基因外顯子、內(nèi)含子及轉(zhuǎn)錄起始點5′端,其中rs17563是惟一位于編碼區(qū)域的SNP位點。已有報道其等位基因C突變?yōu)?T,使產(chǎn)物蛋白質(zhì)分子152位置上的丙氨酸變?yōu)槔i氨酸,這種突變可以降低絕經(jīng)后婦女粗隆間和全髖關(guān)節(jié)的骨密度(P=0.012)[11]。本實驗也證實了此位點T基因的突變具有促使OPLL發(fā)病及增強骨化程度的作用。位點rs2855532同樣由于C-T基因的突變而促進了OPLL的發(fā)病以及增加了骨化椎體數(shù)量。

本研究有以下局限性:未完全覆蓋BMP-4上所有SNPs位點;病例組僅入選頸椎后縱韌帶骨化癥患者,而BMP-4基因單核苷酸多態(tài)性很有可能對骨化范圍涉及胸、腰段的患者有關(guān)聯(lián);兩個位點等位基因的突變?nèi)绾螌?dǎo)致了OPLL的發(fā)生與發(fā)展機制尚不清楚,但是這種突變可能增加了BMP-4在頸椎后縱韌帶中的表達,從而主要通過Smads途徑起到調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄的作用。

一些血清及其他體液中頸椎后縱韌帶骨化癥標(biāo)志物的研究可以對頸椎OPLL起到早期提示及診斷作用。Ito等發(fā)現(xiàn),白細(xì)胞介素-8在脊髓型頸椎病組(n=35)、病例組(n=7)腦脊液中的含量高于正常對照組(n=12)[12]。Yamada等通過測定24例OPLL患者與正常對照組血清發(fā)現(xiàn),男性患者中MK-4(屬于Vitamin K2家族)含量顯著高于對照組男性,而女性間則未顯示出差異[13]。

本病中國人平均發(fā)病率為3.08%[14],目前尚無特殊血液學(xué)、影像學(xué)檢查方法對本病起到早期診斷作用。分子遺傳學(xué)及血清學(xué)的一些研究有助于該病的早期診斷及治療。這些突變的基因如何導(dǎo)致了頸椎后縱韌帶骨化癥的發(fā)生和發(fā)展還待進一步研究闡明。

[1]Tsuyama N.Ossification of the posterior longitudinal ligament of the spine[J].Clin Orthop Relat Res,1984,184:71-84.

[2]T aizo H,Koichi M,Yoshiharu K,et al.A large-scale genetic association study of ossification of the posterior longitudinal ligament of the spine[J].Hum Genet,2006:611-616.

[3]Wilson SG,Reed PW,Andrew T,et al.A genome-screen of a large twin cohort reveals linkage for quantitative ultrasound of the calcaneus to 2q33-37 and 4q12-21[J].J Bone Miner Res,2004,19:270-277.

[4]Karasik D,Myers RH,Cupples LA,et al.Genome screen for quantitative trait loci contributing to normal variation in bone mineral density:the Framingham Study[J].J Bone Miner Res,2002,17:1718-1727.

[5]F rank NY,Kho AT,Schatton T,et al.Regulation of myogenic progenitor proliferation in human fetal skeletal muscle by BM P4 and its antagonist Gremlin[J].J Cell Biol,2006,175:99-110.

[6]Hoshino T,Shimizu R,Ohmo ri S,et al.Reduced BMP-4 abundance in Gata2 hypomorphic mutant mice result in uropathies resembling human CAK UT[J].Genes Cells,2008,13:159-170.

[7]Zakin L,De Robertis EM.Inactivation of mouse Twisted gastrulation reveals its role in promoting BM P-4 activity during forebrain development[J].Development,2004,131:413-424.

[8]Jane JA Jr,Dunford BA,K ron A,et al.Ectopic osteogenesis using adenoviral bone morphogenetic protein(BMP)-4 and BMP-6 gene transfer[J].M ol Ther,2002,6:464-470.

[9]Sato R,Uchida K,Kobayashi S,et al.Ossification of the posterior longitudinal ligament of the cervical spine:histopathological findings around the calcification and ossification front[J].J Neurosurg Spine,2007,7(2):174-183.

[10]Wang Hao,Liu Dongmei,Yang Zhaohui,et al.Association of bone morphogenetic protein-2 gene polymorphisms with susceptibility to ossification of the posterior longitudinal ligament of the spine and its severity in Chinese patients[J].Euro Spine J,2008,17:956-964.

[11]Ramesh Babu L,Wilson SG,Dick IM,et al.Bone mass effects of a BM P-4 gene polymorphism in postmenopausal women[J].Bone,2005,36:555-561.

[12]Ito K,Matsuyama Y,Yukawa Y,et al.Analysis of interleukin-8,interleukin-10,and tumor necrosis factor-αin the cerebrospinal fluid of patients with cervical spondy lotic myelopathy[J].Spinal Disord Tech,2008,21:145-147.

[13]Yamada K,Inui K,Iwamoto M,et al.High serum levels of menatetrenone in male patients with ossification of the posterior longitudinal ligament[J].Spine,2003,28:1789-1793.

[14]Li Z,Zhang G,Sheng C.The incidence of the ossification of the posterior longitudinal ligament in northern region of China[J].Chin J Spine Spinal Cord,1999,9(5):285-286.

Bone Morphogenetic Protein-4 Gene Polymorphism Associated with Ossification of Posterior Longitudinal Ligament in Chinese Pa-tients

ZHAO Wei-guang,XIEYan-ping,YAN Liang,et al.Departmentof Orthopaedics,Tiantan Hospital,Capital Medical University,Beijing 100050,China

ObjectiveTo explore the relationship of single nucleotide polymorphism(SNPs)of the bone morphogenetic protein-4(BMP-4)gene with the morbidity and severity of the ossification of posterior longitudinal ligament(OPLL)of the spine in Chinese patients.MethodsThe venous blood samples of 200 OPLL patients and 200 non-OPLL controls were measured with the DNA sequences in four locus of BMP-4 gene with polymerase chain reaction(PCR).ResultsThere was a significant association between the rs17563,rs2855532 polymorphism and the occurrence of OPLL(P＜0.05).The''T''allele in these 2 SNPs promotes the extent of OPLL(P＜0.05).However,no significant association in morbidity and severity was found between the other 2 SNPs(rs1957860,rs2071047).ConclusionSNPs in rs17563,rs2855532 associates with the morbidity and severity of the ossification of posterior longitudinal ligament of the spine in Chinese patients.

ossification of posterior longitudinal ligament;bone morphogenetic protein-4;gene;single nucleotide polymorphism

[本文著錄格式]趙偉光,謝延平,閆亮,等.骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4基因單核苷酸多態(tài)性與頸椎后縱韌帶骨化癥[J].中國康復(fù)理論與實踐,2011,17(1):39—41.

1.國家自然科學(xué)基金(30872599);2.北京市自然科學(xué)基金(7092028)。

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院骨科,北京市 100050。作者簡介:趙偉光(1984-),男,河北邢臺市人,碩士研究生,主要研究方向:脊柱分子生物力學(xué)。通訊作者:林欣。

R686.5

A

1006-9771(2011)01-0039-03

2010-11-12)

·專題·