肖智勇，張令令，張小銳，周文霞，張永祥

(軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所，北京 100850)

實驗性類風濕性關節(jié)炎動物模型為研究類風濕關節(jié)炎的病因、發(fā)病機制和治療方法提供了有力的工具。理想的類風濕動物模型應該具備以下條件：(1)臨床癥狀、病理和影像學的特點與人類RA相似；(2)盡可能少的具備非 RA的特點；(3)易感的動物品系容易得到且價格便宜；(4)動物可以高效繁殖；(5)可以縮短疾病的自然發(fā)生過程；(6)容易檢測疾病和免疫功能的變化；(7)可以模擬類風濕性關節(jié)炎患者的治療作用。目前類風濕性關節(jié)炎的動物模型有佐劑性關節(jié)炎(adjuvant-induced arthritis，AA)、鏈球菌細胞壁成分(strepococcal cell wall fragments，SCW)誘導的關節(jié)炎、卵蛋白誘導的關節(jié)炎、蛋白多糖誘導的關節(jié)炎、降植烷(pristane)誘導的關節(jié)炎、膠原誘導的關節(jié)炎(collagen induced arthritis，CIA)、轉基因動物模型等［1］。其中 CIA小鼠模型最為常用的模型。

CIA模型是Trentham等1977首次建立的實驗性關節(jié)炎動物模型，是一種免疫性炎癥模型，以多發(fā)性的末端關節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)［2］。T細胞激活、細胞因子分泌和Ⅱ型膠原抗體等的產生是CIA發(fā)病的主要環(huán)節(jié)［3］。但是，目前鮮見Ⅱ型膠原誘導CIA模型的系統(tǒng)免疫學變化的報道。因此，本研究采用DBA/1小鼠誘導了CIA模型，并對其免疫學改變進行了系統(tǒng)研究。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：DBA1/J小鼠，三級，雄性，6～8周，華阜康生物技術有限公司提供［SCXK(京)2009-0004］。實驗時飼養(yǎng)于溫度(20±2)℃和濕度(55± 2)%相對較為恒定的動物飼養(yǎng)室，自由飲水，每日光照/黑暗各12h。

1.1.2 藥品及試劑：完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant，CFA)、牛Ⅱ型膠原(CⅡ)，Chondrex公司，美國。刀豆蛋白 A(concanavalin A，Con A)sigma公司，美國。Lum inex細胞因子試劑盒，Millpore公司，德國；αLISA試劑盒，Perkin Elmer公司，美國。辣根過氧化酶(horseradish peroxidase， HRP)標記的羊抗小鼠IgG，Santacruz公司，美國。

1.1.3 Ⅱ型膠原誘導的關節(jié)炎模型小鼠的制備：將CⅡ溶于0.02mol/L的醋酸中2mg/mL，4℃過夜，將溶解的CⅡ與CFA等體積混和充分乳化(操作在冰上進行)，將乳化后的液體滴在水中后不擴散且成形，視為乳化完全。于DBA/1小鼠尾根靠后1-2cm處皮內注射100μL CⅡ與 CFA的混合乳劑(含CⅡ0.1μg)進行初次免疫，當天記為1d，到21d同樣方法進行第二次免疫。

1.2 實驗方法

1.2.1 CIA小鼠足爪腫脹測量：應用千分尺測量CIA模型小鼠的左右兩側足掌厚度，每周測一次。

1.2.2 關節(jié)炎評分：每3天一次評分，評分標準：0=無紅斑或腫脹。1=輕微的紅斑或一個趾的腫脹。2=紅斑和超過一個趾的腫脹。3=紅斑和踝部或腕部腫脹。4=全部紅斑及腳趾和踝部或手指和腕部的腫脹，踝或腕不能彎曲。

1.2.3 Ⅱ型膠原特異性抗體的測定：將2mg/m L的CⅡ溶于 PPB緩沖液中，濃度為5μg/m L，100μL/孔包被酶標板，4℃過夜；5%FCS封閉酶聯(lián)板4℃，30m in；將樣品以1：10000～50000稀釋后每孔100μL孵育4℃過夜，洗板3次后加100μL/孔二抗(2μg/m L)，4℃孵育至少2h，洗板6次后加入100μL TMB，室溫孵育 15min，用 50μL/孔的2mol/L硫酸(終止液)/孔終止反應。讀取OD450nm。

1.2.4 脾細胞培養(yǎng)上清中IL-17的測定：αLISA技術是基于增強化學發(fā)光的均相免疫檢測技術，是在傳統(tǒng)的ELISA技術基礎上進行的改進，借助微珠進行生物分子檢測，無需洗滌。參照說明書進行操作，5μL/孔標準品或空白對照或 CIA模型小鼠培養(yǎng)上清加入384微孔板，5μL/孔新鮮配制的2.5×抗IL-17受體磁珠和生物素化抗 IL-17抗體混合物(終濃度分別為 10μg/mL、1nM)；23℃，孵育，60m in，40μL/孔2×SA-Donor磁珠(終濃度為40μg/m L)，23℃，避光孵育，30m in；EnVison-Alpha Reader 2103上機檢測，激發(fā)波長 680nm，發(fā)射波長615nm。

1.2.5 脾細胞培養(yǎng)上清TNF-α、IL-1β、IFN-γ和IL-

4含量的測定［4］：應用 Luminex技術檢測 CIA小鼠血清、脾細胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β、IFN-γ和IL-4含量。檢測方法：細胞培養(yǎng)上清經10000rpm離心5m in進一步去除脂質、雜質等有形成分，暫置4℃保存待測。血清混勻，離心后4℃保存待測；參照說明書配置標準品和質控品；每孔200μL Wash buffer潤濕微量滴定過濾板，密封后在搖板機上室溫(20～25℃)振蕩10m in；真空抽除清洗液，使用吸水墊或紙巾吸干板底的水分；在對應的孔中加入25μL標準物或質控液，Assy buffer作為0pg/m L標準物(背景)加入；在樣品孔中加入25μL assy buffer；在背景，標準物和質控孔中加入25μL合適的血清基質；在對應的孔中加入25μL血清或培養(yǎng)上清樣品；充分混合分別能與 TNF-α、IL-1β、IFN-γ和 IL-4結合的4種微球，在每孔中加25μL抗體珠(注意：添加抗體珠時需不時搖動以避免沉淀)；96孔板蓋上蓋子4℃搖動過夜；小心地真空抽除液體；每孔使用200μL清洗液洗板2次，真空抽除清洗液，使用吸水墊或紙巾吸干板底的水分；每孔加入25μL檢測抗體；蓋上蓋子，在室溫(20～25℃)搖動孵育1h (孵育后不要真空抽除)；加入25μL抗生物素蛋白鏈菌素-藻紅素；蓋上蓋子，在室溫(20～25℃)搖動孵育30min；小心地真空抽除全部液體，每孔使用200μL清洗液洗板2次，真空抽除清洗液；在所有孔中加入150μL鞘液。在搖板機上搖板5min以充分重懸抗體珠；使用Lum inexTM200讀板。采集樣品數(shù)據(jù)后，經MasterPlexTMQT軟件分析生成標準曲線，并計算出每個樣品中所含4種細胞因子的濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學分析

實驗結果數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標準差”表示，關節(jié)炎腫脹度的比較采用 SPSS v18.0軟件進行具有一個重復測量的方差分析。兩組間均數(shù)顯著性檢驗采用成組t檢驗。

2 結果

2.1 CIA模型小鼠關節(jié)炎癥狀

CIA小鼠于造模后23d開始，陸續(xù)出現(xiàn)前肢、后肢的紅腫、功能障礙，體重也有明顯下降，但鼻、耳部腫脹不明顯；發(fā)病率高達100%，且隨著時間的延長其關節(jié)腫脹程度呈進行性加重(圖1)。

圖1 CIA小鼠的足爪關節(jié)炎癥狀。

2.1.1 CIA模型小鼠足爪腫脹度

CIA模型小鼠在免疫后27 d，左、右兩側足爪厚度開始出現(xiàn)不同程度的增加，并且隨著造模時間呈進行性加重(圖2)。

圖2 CIA模型小鼠足爪腫脹度。(A)左側、(B)右側。＊＊P＜0.01，n=8

2.1.2 CIA模型小鼠關節(jié)炎評分

由于足爪厚度的測量僅方便于小鼠后肢的測量，我們采用關節(jié)炎評分從整體上觀察CIA小鼠四肢的發(fā)病情況及嚴重程度。結果表明，自免疫后30

d開始，模型小鼠關節(jié)炎評分達8±1，較對照組明顯升高。實驗后期，多數(shù)模型小鼠出現(xiàn)踝部腕部腫脹、變形，不能彎曲，關節(jié)炎評分更為升高(圖3)。

2.2 CIA模型小鼠臟器指數(shù)的變化

實驗結束后取小鼠胸腺、脾臟稱重，實驗結果顯示模型組小鼠脾臟指數(shù)較對照組明顯升高，胸腺指數(shù)則無明顯變化(表1)。

圖3 CIA模型小鼠關節(jié)炎評分。＊＊P＜0.01，n=8

表1 CIA模型小鼠臟器指數(shù)的變化

2.3 CIA模型小鼠T細胞功能的變化

2.3.1 CIA模型小鼠T細胞增殖能力的變化

采用［3H］-TdR摻入法觀察CIA小鼠脾細胞增殖反應的變化。結果表明，模型組脾細胞自發(fā)增殖的cpm值與正常對照組相比明顯降低，但CII刺激的特異性T細胞增殖的cpm值有所升高(表2)。

表2 CIA模型小鼠T細胞增殖能力的變化

2.3.2 CIA模型小鼠脾細胞培養(yǎng)上清細胞因子的變化

CD4+T細胞(T helper，Th0)根據(jù)分泌細胞因子的不同可分為Th1、Th2和 Th17等細胞亞群。Th1細胞主要分泌IL-2、IFN-γ等，介導與細胞毒和局部炎癥有關的免疫應答，參與細胞免疫應答；Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等，可輔助B細胞分化和產生抗體，與體液免疫相關。Th0在 IL-6、TGF-β作用下分化為Th17，Th17主要分泌IL-17，等介導慢性炎癥、器官移植免疫排斥、自身免疫疾病和腫瘤發(fā)生等。Th1/Th2細胞的平衡紊亂、Th17細胞活化被公認為RA發(fā)病的重要機制之一［5］。

應用Luminex液相芯片技術檢測了CIA模型小鼠脾細胞培養(yǎng)上清Th1/Th2細胞因子分泌水平的變化。結果表明，Con A誘導的CIA模型小鼠脾細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4含量及IFN-γ/IL-4比值均較正常對照組明顯升高。αLISA技術檢測脾細胞培養(yǎng)上清IL-17含量，發(fā)現(xiàn)CIA模型小鼠脾細胞培養(yǎng)上清中IL-17含量與正常對照組比較無明顯變化(表3)。

表3 CIA模型小鼠T細胞細胞因子分泌的改變

2.4 CIA模型小鼠巨噬細胞功能的變化

RA患者滑膜細胞、單核巨噬細胞和淋巴細胞可產生大量致炎性細胞因子如 TNF-α、IL-1β等，參與骨、關節(jié)損傷。本研究采用LPS誘導的小鼠脾細胞，Luminex技術檢測脾細胞培養(yǎng)上清中 TNF-α和IL-1β水平，實驗結果顯示模型組 TNF-α和 IL-1β水平較正常對照組明顯升高(表4)。

2.5 CIA模型小鼠抗體生成的動態(tài)變化

初次免疫后 5、7、9周采血，檢測小鼠血清總IgG分泌水平變化情況。結果表明，正常對照組小鼠血清中未檢測到CII特異性IgG，而CIA模型小鼠血清中CII特異性IgG明顯升高(表5)。

表4 CIA模型小鼠巨噬細胞細胞因子分泌的改變

表5 CIA模型小鼠血清CII特異性IgG的變化

3 討論

本研究采用 II型膠原和弗氏完全佐劑免疫DBA/1小鼠，成功誘導了小鼠類風濕性關節(jié)炎動物模型。該模型的特點是初次免疫約30天后，小鼠雙側足爪明顯腫脹，關節(jié)炎評分升高，且隨造模時間延長疾病呈進行性加重趨勢。免疫學參數(shù)研究表明，模型小鼠脾臟指數(shù)增加，抗原特異性 T細胞活化，分泌大量炎性細胞因子如 IFN-γ、TNF-α和 IL-1β等。同時，還存在 B細胞的過度活化，血清 CII抗體表達水平顯著升高。CIA小鼠的臨床特征和免疫學參數(shù)的變化和人類具有較高的一致性，是 RA作用機制研究和藥物研發(fā)的理想模型。

CIA的建立要用異源性(?；螂u)II膠原(CII)分兩次免疫易感動物如DBA/1小鼠，其機制主要包括以下方面：首先，與發(fā)病相關的CII抗原肽必須有核心肽段。CII是由三條1018個氨基酸的α鏈組成的同源三聚體，其中的CII 260～270段含有能結合MHCⅡ分子和被TCR識別的功能氨基酸，被稱為RA或CIA發(fā)生的核心抗原肽段。該核心肽段在常溫下容易降解，這也是在乳化膠原時為什么要求在4℃環(huán)境下進行操作的原因。近交系DBA/1是H-2q單倍型小鼠，H-2q對 CII核心肽段有較強的易感性，能產生較強的T細胞擴增，繼而誘導 CIA產生。

其次，具備與CIA易感相關的MHCⅡ類分子。RA的易患性與HLA-DR和HLA-DQ的一些等位基因亞型密切相關，它們所表達的DR及DQ分子可以提呈CII 260-270等自身抗原肽，并識別特異性TCR，從而激活T細胞。鼠類對CIA的易患性同樣與MHCⅡ類分子關系密切。小鼠IA基因與HLADQ同源，IE基因與HLA-DR基因同源。研究發(fā)現(xiàn)，IA分子β1鏈的多態(tài)性決定了CIA的易患性，IE分子也參與CIA病理過程的調節(jié)，與CIA的發(fā)生率和嚴重性有關。對IA、IE及DQ、DR的序列分析表明，無論人或小鼠，RA/CIA易患的等位基因亞型表達的MHCⅡ類分子β1鏈在70-74位氨基酸序列上多具有(QK/RRAA)的保守序列即所謂的共同表位(shared epitope)［6］。這些相鄰氨基酸殘基的側鏈分子組成的空間結構，是抗原肽的關鍵結合部位。H-2q小鼠表達的MHC-Ⅱ類分子為IAq和IEq，其中識別提呈CII抗原的MHCⅡ類分子為IAq，所以IAq小鼠(如：DBA/1、B10.Q)常被用來制作 CIA動物模型［7］。

［1］Hegen M，Keith Jr JC，Collins M，Nickerson-Nutter CL.Utility of animal models for identification of potential therapeutics for rheumatoid arthritis［J］.Ann Rheum Dis.2008，67：1505-1515.

［2］Myers LK，Rosloniec EF，Cremer MA，et al.Collagen-induced arthritis，an animal model of autoimmunity［J］.Life Science.1997，61：1861-1878.

［3］Van den berg WB.Animal models of arthritis.What have we learned?［J］.J Rheumatol Suppl.2005，72(1)：7-9.

［4］Lu LD，Stump KL，Seavey MM.Novel Method of Monitoring Trace Cytokines and Activated STAT Molecules in the Paws of Arthritic Mice using Multip lex Bead Technology［J］.BMC Immunology.2010，11：55.

［5］Koshy PJ，Henderson N，Logan C，et al.Interleukin 17 induces cartilage collagen breakdown： novel synergistic effects in combination with proinflammatory cytokines［J］.Ann Rheum Dis.2002，61：704-713.

［6］Gregersen PK，Silver J，W inchester RJ.The shared epitope hypothesis，an approach to understanding the molecular genetics of susceptibility to rheumatoid arthritis［J］.Arthritis Rheum.1987，30：1205-1213.

［7］Rosloniec EF，Whiffington KB，Brand DD，et al.Identification of MHC classⅡand TCR binding residues in the type II collagen immunodominant determinant mediating collagen-induced arthritis［J］.Cell Immunol.1996，172：21-22.