肖智勇，張令令，張小銳，周文霞，張永祥

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 100850)

實(shí)驗性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動物模型為研究類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病因、發(fā)病機(jī)制和治療方法提供了有力的工具。理想的類風(fēng)濕動物模型應(yīng)該具備以下條件：(1)臨床癥狀、病理和影像學(xué)的特點(diǎn)與人類RA相似；(2)盡可能少的具備非 RA的特點(diǎn)；(3)易感的動物品系容易得到且價格便宜；(4)動物可以高效繁殖；(5)可以縮短疾病的自然發(fā)生過程；(6)容易檢測疾病和免疫功能的變化；(7)可以模擬類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的治療作用。目前類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的動物模型有佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant-induced arthritis，AA)、鏈球菌細(xì)胞壁成分(strepococcal cell wall fragments，SCW)誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、卵蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、蛋白多糖誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、降植烷(pristane)誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis，CIA)、轉(zhuǎn)基因動物模型等［1］。其中 CIA小鼠模型最為常用的模型。

CIA模型是Trentham等1977首次建立的實(shí)驗性關(guān)節(jié)炎動物模型，是一種免疫性炎癥模型，以多發(fā)性的末端關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)［2］。T細(xì)胞激活、細(xì)胞因子分泌和Ⅱ型膠原抗體等的產(chǎn)生是CIA發(fā)病的主要環(huán)節(jié)［3］。但是，目前鮮見Ⅱ型膠原誘導(dǎo)CIA模型的系統(tǒng)免疫學(xué)變化的報道。因此，本研究采用DBA/1小鼠誘導(dǎo)了CIA模型，并對其免疫學(xué)改變進(jìn)行了系統(tǒng)研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗材料

1.1.1 實(shí)驗動物：DBA1/J小鼠，三級，雄性，6～8周，華阜康生物技術(shù)有限公司提供［SCXK(京)2009-0004］。實(shí)驗時飼養(yǎng)于溫度(20±2)℃和濕度(55± 2)%相對較為恒定的動物飼養(yǎng)室，自由飲水，每日光照/黑暗各12h。

1.1.2 藥品及試劑：完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant，CFA)、牛Ⅱ型膠原(CⅡ)，Chondrex公司，美國。刀豆蛋白 A(concanavalin A，Con A)sigma公司，美國。Lum inex細(xì)胞因子試劑盒，Millpore公司，德國；αLISA試劑盒，Perkin Elmer公司，美國。辣根過氧化酶(horseradish peroxidase， HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，Santacruz公司，美國。

1.1.3 Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型小鼠的制備：將CⅡ溶于0.02mol/L的醋酸中2mg/mL，4℃過夜，將溶解的CⅡ與CFA等體積混和充分乳化(操作在冰上進(jìn)行)，將乳化后的液體滴在水中后不擴(kuò)散且成形，視為乳化完全。于DBA/1小鼠尾根靠后1-2cm處皮內(nèi)注射100μL CⅡ與 CFA的混合乳劑(含CⅡ0.1μg)進(jìn)行初次免疫，當(dāng)天記為1d，到21d同樣方法進(jìn)行第二次免疫。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 CIA小鼠足爪腫脹測量：應(yīng)用千分尺測量CIA模型小鼠的左右兩側(cè)足掌厚度，每周測一次。

1.2.2 關(guān)節(jié)炎評分：每3天一次評分，評分標(biāo)準(zhǔn)：0=無紅斑或腫脹。1=輕微的紅斑或一個趾的腫脹。2=紅斑和超過一個趾的腫脹。3=紅斑和踝部或腕部腫脹。4=全部紅斑及腳趾和踝部或手指和腕部的腫脹，踝或腕不能彎曲。

1.2.3 Ⅱ型膠原特異性抗體的測定：將2mg/m L的CⅡ溶于 PPB緩沖液中，濃度為5μg/m L，100μL/孔包被酶標(biāo)板，4℃過夜；5%FCS封閉酶聯(lián)板4℃，30m in；將樣品以1：10000～50000稀釋后每孔100μL孵育4℃過夜，洗板3次后加100μL/孔二抗(2μg/m L)，4℃孵育至少2h，洗板6次后加入100μL TMB，室溫孵育 15min，用 50μL/孔的2mol/L硫酸(終止液)/孔終止反應(yīng)。讀取OD450nm。

1.2.4 脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17的測定：αLISA技術(shù)是基于增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光的均相免疫檢測技術(shù)，是在傳統(tǒng)的ELISA技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)行的改進(jìn)，借助微珠進(jìn)行生物分子檢測，無需洗滌。參照說明書進(jìn)行操作，5μL/孔標(biāo)準(zhǔn)品或空白對照或 CIA模型小鼠培養(yǎng)上清加入384微孔板，5μL/孔新鮮配制的2.5×抗IL-17受體磁珠和生物素化抗 IL-17抗體混合物(終濃度分別為 10μg/mL、1nM)；23℃，孵育，60m in，40μL/孔2×SA-Donor磁珠(終濃度為40μg/m L)，23℃，避光孵育，30m in；EnVison-Alpha Reader 2103上機(jī)檢測，激發(fā)波長 680nm，發(fā)射波長615nm。

1.2.5 脾細(xì)胞培養(yǎng)上清TNF-α、IL-1β、IFN-γ和IL-

4含量的測定［4］：應(yīng)用 Luminex技術(shù)檢測 CIA小鼠血清、脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β、IFN-γ和IL-4含量。檢測方法：細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng)10000rpm離心5m in進(jìn)一步去除脂質(zhì)、雜質(zhì)等有形成分，暫置4℃保存待測。血清混勻，離心后4℃保存待測；參照說明書配置標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品；每孔200μL Wash buffer潤濕微量滴定過濾板，密封后在搖板機(jī)上室溫(20～25℃)振蕩10m in；真空抽除清洗液，使用吸水墊或紙巾吸干板底的水分；在對應(yīng)的孔中加入25μL標(biāo)準(zhǔn)物或質(zhì)控液，Assy buffer作為0pg/m L標(biāo)準(zhǔn)物(背景)加入；在樣品孔中加入25μL assy buffer；在背景，標(biāo)準(zhǔn)物和質(zhì)控孔中加入25μL合適的血清基質(zhì)；在對應(yīng)的孔中加入25μL血清或培養(yǎng)上清樣品；充分混合分別能與 TNF-α、IL-1β、IFN-γ和 IL-4結(jié)合的4種微球，在每孔中加25μL抗體珠(注意：添加抗體珠時需不時搖動以避免沉淀)；96孔板蓋上蓋子4℃搖動過夜；小心地真空抽除液體；每孔使用200μL清洗液洗板2次，真空抽除清洗液，使用吸水墊或紙巾吸干板底的水分；每孔加入25μL檢測抗體；蓋上蓋子，在室溫(20～25℃)搖動孵育1h (孵育后不要真空抽除)；加入25μL抗生物素蛋白鏈菌素-藻紅素；蓋上蓋子，在室溫(20～25℃)搖動孵育30min；小心地真空抽除全部液體，每孔使用200μL清洗液洗板2次，真空抽除清洗液；在所有孔中加入150μL鞘液。在搖板機(jī)上搖板5min以充分重懸抗體珠；使用Lum inexTM200讀板。采集樣品數(shù)據(jù)后，經(jīng)MasterPlexTMQT軟件分析生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算出每個樣品中所含4種細(xì)胞因子的濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析

實(shí)驗結(jié)果數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，關(guān)節(jié)炎腫脹度的比較采用 SPSS v18.0軟件進(jìn)行具有一個重復(fù)測量的方差分析。兩組間均數(shù)顯著性檢驗采用成組t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 CIA模型小鼠關(guān)節(jié)炎癥狀

CIA小鼠于造模后23d開始，陸續(xù)出現(xiàn)前肢、后肢的紅腫、功能障礙，體重也有明顯下降，但鼻、耳部腫脹不明顯；發(fā)病率高達(dá)100%，且隨著時間的延長其關(guān)節(jié)腫脹程度呈進(jìn)行性加重(圖1)。

圖1 CIA小鼠的足爪關(guān)節(jié)炎癥狀。

2.1.1 CIA模型小鼠足爪腫脹度

CIA模型小鼠在免疫后27 d，左、右兩側(cè)足爪厚度開始出現(xiàn)不同程度的增加，并且隨著造模時間呈進(jìn)行性加重(圖2)。

圖2 CIA模型小鼠足爪腫脹度。(A)左側(cè)、(B)右側(cè)。＊＊P＜0.01，n=8

2.1.2 CIA模型小鼠關(guān)節(jié)炎評分

由于足爪厚度的測量僅方便于小鼠后肢的測量，我們采用關(guān)節(jié)炎評分從整體上觀察CIA小鼠四肢的發(fā)病情況及嚴(yán)重程度。結(jié)果表明，自免疫后30

d開始，模型小鼠關(guān)節(jié)炎評分達(dá)8±1，較對照組明顯升高。實(shí)驗后期，多數(shù)模型小鼠出現(xiàn)踝部腕部腫脹、變形，不能彎曲，關(guān)節(jié)炎評分更為升高(圖3)。

2.2 CIA模型小鼠臟器指數(shù)的變化

實(shí)驗結(jié)束后取小鼠胸腺、脾臟稱重，實(shí)驗結(jié)果顯示模型組小鼠脾臟指數(shù)較對照組明顯升高，胸腺指數(shù)則無明顯變化(表1)。

圖3 CIA模型小鼠關(guān)節(jié)炎評分。＊＊P＜0.01，n=8

表1 CIA模型小鼠臟器指數(shù)的變化

2.3 CIA模型小鼠T細(xì)胞功能的變化

2.3.1 CIA模型小鼠T細(xì)胞增殖能力的變化

采用［3H］-TdR摻入法觀察CIA小鼠脾細(xì)胞增殖反應(yīng)的變化。結(jié)果表明，模型組脾細(xì)胞自發(fā)增殖的cpm值與正常對照組相比明顯降低，但CII刺激的特異性T細(xì)胞增殖的cpm值有所升高(表2)。

表2 CIA模型小鼠T細(xì)胞增殖能力的變化

2.3.2 CIA模型小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞因子的變化

CD4+T細(xì)胞(T helper，Th0)根據(jù)分泌細(xì)胞因子的不同可分為Th1、Th2和 Th17等細(xì)胞亞群。Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ等，介導(dǎo)與細(xì)胞毒和局部炎癥有關(guān)的免疫應(yīng)答，參與細(xì)胞免疫應(yīng)答；Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等，可輔助B細(xì)胞分化和產(chǎn)生抗體，與體液免疫相關(guān)。Th0在 IL-6、TGF-β作用下分化為Th17，Th17主要分泌IL-17，等介導(dǎo)慢性炎癥、器官移植免疫排斥、自身免疫疾病和腫瘤發(fā)生等。Th1/Th2細(xì)胞的平衡紊亂、Th17細(xì)胞活化被公認(rèn)為RA發(fā)病的重要機(jī)制之一［5］。

應(yīng)用Luminex液相芯片技術(shù)檢測了CIA模型小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清Th1/Th2細(xì)胞因子分泌水平的變化。結(jié)果表明，Con A誘導(dǎo)的CIA模型小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4含量及IFN-γ/IL-4比值均較正常對照組明顯升高。αLISA技術(shù)檢測脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-17含量，發(fā)現(xiàn)CIA模型小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17含量與正常對照組比較無明顯變化(表3)。

表3 CIA模型小鼠T細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的改變

2.4 CIA模型小鼠巨噬細(xì)胞功能的變化

RA患者滑膜細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生大量致炎性細(xì)胞因子如 TNF-α、IL-1β等，參與骨、關(guān)節(jié)損傷。本研究采用LPS誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞，Luminex技術(shù)檢測脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中 TNF-α和IL-1β水平，實(shí)驗結(jié)果顯示模型組 TNF-α和 IL-1β水平較正常對照組明顯升高(表4)。

2.5 CIA模型小鼠抗體生成的動態(tài)變化

初次免疫后 5、7、9周采血，檢測小鼠血清總IgG分泌水平變化情況。結(jié)果表明，正常對照組小鼠血清中未檢測到CII特異性IgG，而CIA模型小鼠血清中CII特異性IgG明顯升高(表5)。

表4 CIA模型小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的改變

表5 CIA模型小鼠血清CII特異性IgG的變化

3 討論

本研究采用 II型膠原和弗氏完全佐劑免疫DBA/1小鼠，成功誘導(dǎo)了小鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動物模型。該模型的特點(diǎn)是初次免疫約30天后，小鼠雙側(cè)足爪明顯腫脹，關(guān)節(jié)炎評分升高，且隨造模時間延長疾病呈進(jìn)行性加重趨勢。免疫學(xué)參數(shù)研究表明，模型小鼠脾臟指數(shù)增加，抗原特異性 T細(xì)胞活化，分泌大量炎性細(xì)胞因子如 IFN-γ、TNF-α和 IL-1β等。同時，還存在 B細(xì)胞的過度活化，血清 CII抗體表達(dá)水平顯著升高。CIA小鼠的臨床特征和免疫學(xué)參數(shù)的變化和人類具有較高的一致性，是 RA作用機(jī)制研究和藥物研發(fā)的理想模型。

CIA的建立要用異源性(?；螂u)II膠原(CII)分兩次免疫易感動物如DBA/1小鼠，其機(jī)制主要包括以下方面：首先，與發(fā)病相關(guān)的CII抗原肽必須有核心肽段。CII是由三條1018個氨基酸的α鏈組成的同源三聚體，其中的CII 260～270段含有能結(jié)合MHCⅡ分子和被TCR識別的功能氨基酸，被稱為RA或CIA發(fā)生的核心抗原肽段。該核心肽段在常溫下容易降解，這也是在乳化膠原時為什么要求在4℃環(huán)境下進(jìn)行操作的原因。近交系DBA/1是H-2q單倍型小鼠，H-2q對 CII核心肽段有較強(qiáng)的易感性，能產(chǎn)生較強(qiáng)的T細(xì)胞擴(kuò)增，繼而誘導(dǎo) CIA產(chǎn)生。

其次，具備與CIA易感相關(guān)的MHCⅡ類分子。RA的易患性與HLA-DR和HLA-DQ的一些等位基因亞型密切相關(guān)，它們所表達(dá)的DR及DQ分子可以提呈CII 260-270等自身抗原肽，并識別特異性TCR，從而激活T細(xì)胞。鼠類對CIA的易患性同樣與MHCⅡ類分子關(guān)系密切。小鼠IA基因與HLADQ同源，IE基因與HLA-DR基因同源。研究發(fā)現(xiàn)，IA分子β1鏈的多態(tài)性決定了CIA的易患性，IE分子也參與CIA病理過程的調(diào)節(jié)，與CIA的發(fā)生率和嚴(yán)重性有關(guān)。對IA、IE及DQ、DR的序列分析表明，無論人或小鼠，RA/CIA易患的等位基因亞型表達(dá)的MHCⅡ類分子β1鏈在70-74位氨基酸序列上多具有(QK/RRAA)的保守序列即所謂的共同表位(shared epitope)［6］。這些相鄰氨基酸殘基的側(cè)鏈分子組成的空間結(jié)構(gòu)，是抗原肽的關(guān)鍵結(jié)合部位。H-2q小鼠表達(dá)的MHC-Ⅱ類分子為IAq和IEq，其中識別提呈CII抗原的MHCⅡ類分子為IAq，所以IAq小鼠(如：DBA/1、B10.Q)常被用來制作 CIA動物模型［7］。

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