郭家彬，彭雙清

(軍事醫(yī)學科學院疾病預(yù)防控制所，毒理學評價研究中心，北京 100071)

隨著人們對動物保護與動物福利的關(guān)注和重視以及實驗動物使用“3R”原則在全球范圍內(nèi)的廣泛倡導(dǎo)與實施，動物實驗受到越來越嚴格的限制。另一方面，經(jīng)濟和社會的快速發(fā)展，化學物質(zhì)等有害因素暴露的種類及數(shù)量日益增多，亟待進行毒性測試與風險評估。傳統(tǒng)的毒性測試主要依賴于大量的動物實驗，其實驗周期長、花費大，且由于種屬差異等原因而使實驗結(jié)果在預(yù)測人體毒性風險時存在較大的不確定性，已經(jīng)難以滿足化學物質(zhì)等有害因素的評價需求。近年來，采用體外試驗、低等生物和非生物載體等技術(shù)方法替代傳統(tǒng)的動物實驗已成為外源性化合物毒性測試的重要發(fā)展方向，并在毒理學領(lǐng)域獲得快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，逐步形成了具鮮明特色的替代毒理學這一分支學科［1］。替代毒理學就是動物實驗替代方法在毒理學領(lǐng)域的研究和應(yīng)用，滲透了“3R”原則的全部內(nèi)容，它不僅是動物保護與動物福利考慮的需要，也是毒理學學科發(fā)展以及社會經(jīng)濟發(fā)展的需要與科學要求。

1 動物實驗替代方法的概述

1.1 “3R”原則與動物實驗替代方法

早在1959年英國動物學家Russell和微生物學家Burch在其著作《人道主義實驗技術(shù)原理》中首次系統(tǒng)地提出了“3R”原則，其核心內(nèi)容即指減少(reduction)、替代(rep lacement)和優(yōu)化(refinement)。“3R”原則旨在促進科學、合理、人道地使用實驗動物，在保證實驗科學性的前提下盡可能地減少實驗動物的使用、減輕或消除動物痛苦，著力提高動物福利。“3R”原則自提出以來，受到歐美等發(fā)達國家和地區(qū)的高度重視，得到政府管理部門、學者和民間越來越廣泛的支持。歐盟、美國和日本等多個國家和地區(qū)已制定相關(guān)法律法規(guī)以加強“3R”原則的貫徹實施。我國在2006年由國家科技部發(fā)布了《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》，明確指出動物實驗應(yīng)遵循“3R”原則。

1.2 動物實驗替代方法的內(nèi)涵

“替代”是“3R”原則的核心內(nèi)容之一。廣義而言，動物實驗替代方法就是指采用新的技術(shù)方法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的或舊的動物實驗，任何一種能夠減少動物使用和/或減輕動物痛苦、提高動物福利的方法都可視為動物實驗替代方法。動物實驗替代的基本方法主要包括［2］，①應(yīng)用體外試驗替代整體動物試驗，如體外培養(yǎng)的動物或人源細胞、組織和器官等，細胞系和人組織標本等；②應(yīng)用低等生物和有限知覺的生物體替代脊椎動物試驗，如植物、細菌、果蠅和斑馬魚等；③應(yīng)用數(shù)學、物理和化學技術(shù)方法和計算機模型等非生物手段，如利用結(jié)構(gòu)-效應(yīng)關(guān)系(SAR)模型預(yù)測化合物的潛在生物學效應(yīng)。從替代的層次和目的而言，動物實驗替代方法可分為減少性替代、替代性研究和優(yōu)化性替代。減少性替代是指在保證獲得等同信息甚至更多有用信息的條件下，采用新的替代方法以減少動物使用數(shù)量和/或縮短動物實驗時間。如在藥物急性毒性試驗中，采用上下法既能獲得動物半數(shù)致死劑量值(LD50)，又能大大減少動物使用數(shù)量。替代性研究主要是指采用無脊椎動物或非動物實驗手段替代脊椎動物實驗。優(yōu)化性替代主要是指在動物飼養(yǎng)、管理和/或試驗過程中，采用新的技術(shù)方法進行優(yōu)化完善，著力提高實驗規(guī)范化水平和動物福利。因此，從某種程度上而言，替代從不同層面和不同角度涵蓋了“3R”原則的所有內(nèi)容。

1.3 動物實驗替代方法的建立、驗證與管理認可

動物實驗替代方法是基于科學實驗的需求以及動物保護與動物福利的充分考慮而設(shè)計的。一種新的動物實驗替代方法首先必須具有一定的科學性、可靠性、有效性、可操作性和經(jīng)濟性以及應(yīng)用價值，與現(xiàn)行的動物試驗方法有較好的相關(guān)性和一致性，其結(jié)果能夠較好地預(yù)測受試物的體內(nèi)生物學效應(yīng)［3］。在應(yīng)用新的試驗方法替代傳統(tǒng)的動物實驗時，必須對該方法進行適當?shù)尿炞C研究，以證明新方法的可信性和相關(guān)性符合特定目的，即對替代法進行驗證。驗證是基于某一特定目的，依據(jù)科學的程序而評價和確定新方法的可信性和相關(guān)性的過程?？尚判允侵冈诓煌瑫r間、不同實驗室之間檢測結(jié)果的重復(fù)性。相關(guān)性是指基于特定目的，某種方法或試驗系統(tǒng)的科學基礎(chǔ)和相關(guān)模型的預(yù)測能力，它反映替代法的科學意義和適用性。替代法經(jīng)驗證成功后遞交給管理機構(gòu)進行審核、批準，這一過程即為管理認可。歐盟、美國、德國、日本、荷蘭、澳大利亞等國家和地區(qū)已經(jīng)建立了專門的機構(gòu)開展替代方法的建立、驗證和管理等工作，如歐洲替代法驗證中心(ECVAM)、美國替代方法驗證協(xié)調(diào)委員會(ICCVAM)、德國動物實驗替代方法評價研究中心(ZEBET)、日本動物實驗替代方法學會(JSAAE)和荷蘭國家替代法研究中心(NCA)等。截至2011年7月，已有69種動物實驗替代方法獲得了經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(OECD)等組織的管理認可［4］。我國替代法研究起步較晚，目前尚未建立專門的替代法驗證與管理認可機構(gòu)。

2 21世紀毒性測試面臨著嚴峻挑戰(zhàn)

當前，食品和藥品安全、環(huán)境污染和職業(yè)衛(wèi)生等已成為國際和我國社會和經(jīng)濟發(fā)展所面臨的重大問題。特別是在我國，近年來食品和藥品安全事件以及環(huán)境污染等問題十分突出，嚴重影響著我國居民的身心健康和經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展。評價外源性化學物質(zhì)及物理性和生物性等有害因素對生物體，特別是人體產(chǎn)生的危害及其毒性作用機制是毒理學學科的主要任務(wù)。對外源性化合物或其它有害因素進行毒性測試，是評估這些有害因素暴露風險的基礎(chǔ)。然而，在過去近40年期間，毒理學的核心測試試驗方法幾乎沒有發(fā)生改變［5］。如何對迅速增長的化學物等有害因素進行快速、準確的毒性測試已經(jīng)成為21世紀毒理學發(fā)展所面臨的嚴峻挑戰(zhàn)。

首先，新老化學物暴露急劇增加，毒性測試任務(wù)十分艱巨。以歐盟為例，年產(chǎn)量為1～100噸的化學物就超過30，000種，而人們僅對其中少數(shù)化學品獲知其毒理學特征［6］。據(jù)估計，超過86%的化合物缺乏系統(tǒng)的毒理學數(shù)據(jù)。隨著組合化學等技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，每天還有大量的新化學物形成，有待進行毒性測試和暴露風險評估。而高昂的動物實驗費用、冗長的實驗周期嚴重制約毒性測試的快速發(fā)展。據(jù)統(tǒng)計，全世界平均每年動物實驗花費近140億美元，其中近30億用于毒理學試驗。平均一個化合物的毒性測試周期為3.5年；其次，由于動物種屬和個體差異，動物實驗?zāi)Ｐ碗y以反映真實的人體反應(yīng)。盡管人們熟知動物實驗的局限性，但對于動物模型的準確性卻鮮有報道。有研究表明，在能引起兔子發(fā)生皮膚刺激反應(yīng)的化合物中僅有40%可在人體中引發(fā)類似反應(yīng)［7］。類似地，一項國際驗證試驗表明，化合物在大鼠中的半數(shù)致死劑量(LD50)值與人體血液中的致死劑量相關(guān)性并不好(相關(guān)系數(shù)僅為0.56)［8］。值得注意的是，動物實驗中所采用的動物多為遺傳背景相同、均一性的動物或特定的動物模型，而實際接觸化合物的人群則有可能千差萬別；再次，在傳統(tǒng)的毒性測試中，為了更好地暴露化合物的潛在毒性，所采用的劑量常常遠高于人體中的實際暴露劑量，而且試驗所檢測的毒理學終點與評價指標可能也與臨床人體試驗存在較大差異。因此，這些毒性測試試驗結(jié)果在預(yù)測人體毒性時很容易出現(xiàn)假陽性和假陰性錯誤。

2006年12月18日，歐盟議會和歐盟理事會正式共同通過了化學品新政策的法規(guī)草案《關(guān)于化學品注冊、評估、許可和限制》，簡稱REACH法規(guī)。依照《REACH法規(guī)》規(guī)定，自2009年3月11日起，在歐盟范圍內(nèi)禁止用動物進行化妝品急性毒性、眼刺激性和過敏性試驗；2013年將禁止用動物進行慢性毒性、生殖毒性和毒物代謝動力學試驗。人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(ICH)、美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)和美國環(huán)境保護署(EPA)等部門近年來也頒布了多部相關(guān)管理法規(guī)和技術(shù)指南，明確要求或推薦采用體外試驗以替代傳統(tǒng)動物試驗。這些法律法規(guī)的實施為動物保護和動物福利提供了有力保障，有些動物實驗替代方法還將成為毒性測試的必然選擇。

3 基于動物實驗替代方法的毒性測試策略-毒理學替代法

毒理學是動物實驗應(yīng)用最為廣泛的學科之一。近年來，動物實驗替代法越來越受到國內(nèi)外毒理學工作者的關(guān)注和重視，并在毒理學領(lǐng)域獲得快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，逐步形成了基于動物實驗替代方法的毒性測試新策略，即毒理學替代法。在毒理學領(lǐng)域，任何能夠優(yōu)化動物使用(如減輕或消除動物痛苦)、減少動物使用、采用非動物檢測系統(tǒng)(如體外培養(yǎng)的細胞、計算機預(yù)測模型)或低等動物(如魚、昆蟲類)等技術(shù)方法開展的試驗都可視為毒理學替代法，納入替代毒理學的研究范疇［1］。毒理學替代法是“3R”原則在毒理學學科中的具體實踐與應(yīng)用。無論是從毒理學學科的科學發(fā)展角度還是從經(jīng)濟角度考慮，毒理學替代法對外源性化學物的危害性評價及管理均具有重要的意義，在減少動物使用、減少實驗影響因素、縮短實驗周期、降低實驗成本、闡明毒性作用機制以及提高動物福利等諸多方面都較傳統(tǒng)動物試驗有著明顯的優(yōu)勢。

針對21世紀毒性測試與毒理學發(fā)展面臨的挑戰(zhàn)和前景展望，2007年美國國家研究院(NRC)發(fā)表了一份具有里程碑意義的報告，即《21世紀毒性測試：遠景與策略》［9］。該報告為未來毒性測試的發(fā)展提供了十分重要的策略參考，突出強調(diào)21世紀毒性測試的重點將由整體動物試驗轉(zhuǎn)向基于人類細胞、細胞系和/或細胞組分等實驗動物替代方法的測試策略。未來毒性測試的主要內(nèi)容包括化學物的特性分析、含毒性通路和靶向測試的毒性測試以及劑量-反應(yīng)與外推模型的研究，通過這些研究進一步開展外源性化合物的危險度評價和人群與暴露資料的分析，如圖1所示。毒性測試的重點關(guān)注因素包括敏感檢測終點的選擇與評價、細胞-反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)、高通量與中通量方法的構(gòu)建與應(yīng)用、作用機制與作用模式、毒性通路以及系統(tǒng)生物學效應(yīng)等，著力實施高通量、高靈敏度、低成本、預(yù)測能力強而且準確的毒性測試策略［9-11］。因此，未來的毒性預(yù)測將主要依賴于體外試驗和基于計算機、數(shù)學等模型的非生物學試驗，傳統(tǒng)動物試驗將可能被部分替代甚至完全替代。NRC這份報告自提出以來，引起了學術(shù)界、政府管理部門以及工業(yè)界等的強烈反響。美國EPA和國立衛(wèi)生研究院等機構(gòu)合作，迅速啟動了一個重大研究計劃開展相關(guān)研究。2011年3月，英國聯(lián)合利華公司在中國上海召開了21世紀毒性測試策略研討會，積極尋求包括中國在內(nèi)的合作與交流。

圖1 NRC提出的21世紀毒性測試遠景策略

4 實驗動物替代方法在毒理學領(lǐng)域的發(fā)展與應(yīng)用

近年來，動物實驗替代方法在毒理學領(lǐng)域的發(fā)展十分迅速。毒理學替代法已經(jīng)涵蓋了一般毒性、靶器官毒性、遺傳毒性、致癌性和局部毒性等多種毒性終點，研究手段與技術(shù)方法也從一般的組織細胞培養(yǎng)發(fā)展形成了成含基因組學、蛋白質(zhì)組學、代謝組學、系統(tǒng)生物學、計算機模擬和生物信息學等多學科、多層次的綜合評價體系［12］。毒理學替代法已被越來越廣泛地應(yīng)用于藥品、新化學物、食品添加劑、農(nóng)藥、消毒產(chǎn)品、生物制品、化妝品和日用品等的毒性測試，其中有些替代方法還通過了ECVAM等權(quán)威機構(gòu)的驗證，并被歐盟和美國等國家和地區(qū)納入法規(guī)管理范圍。以下結(jié)合本實驗室近年來開展的研究工作，列舉部分毒理學替代法的研究進展與應(yīng)用。

4.1 急性毒性試驗

急性毒性試驗對于評定化學物急性毒性效應(yīng)的強弱、確定致死劑量大小有著重要意義。急性毒性試驗的動物替代策略主要包括動物減少性替代和體外試驗替代。減少性替代方法仍然以動物實驗為主，但動物數(shù)量比傳統(tǒng)急性毒性試驗明顯減少。如固定劑量法、上下法、探測劑量法、累積劑量設(shè)計法、近似致死劑量法和限量試驗等。這些替代方法均可有效地減少實驗動物數(shù)量。OECD已修訂發(fā)布了3種檢測經(jīng)口急性毒性試驗方法，包括急性毒性分級法、固定劑量法和上下法。研究表明，化學物體外細胞毒性與體內(nèi)急性毒性之間存在正相關(guān)性，因此可利用體外試驗方法對體內(nèi)急性毒性進行定量預(yù)測。目前常用的體外細胞毒性檢測方法有中性紅攝取法、噻唑蘭(MTT)法和乳酸酶漏出法等。本實驗室采用MTT法檢測了多種抗病毒先導(dǎo)化合物的細胞毒性，并通過數(shù)學模型計算獲得其LD50預(yù)測值，結(jié)果顯示這些預(yù)測值與體內(nèi)試驗獲得的LD50值相似［13，14］。目前，已有2種體外試驗方法通過美國ICCVAM的驗證并于2010年獲得OECD的管理認可，另有多種替代方法尚處在驗證階段［4］。

4.2 心血管毒性評價

心血管系統(tǒng)是許多外源性化合物毒性作用的重要靶器官。近年來，由心臟QT間期延長而導(dǎo)致的心血管毒性事件已成為新藥研發(fā)失敗和已上市藥物撤市的主要原因之一。研究表明，QT間期延長與心肌細胞HERG離子通道抑制密切相關(guān)。為了更好地發(fā)現(xiàn)藥物可能存在的心臟毒性風險，ICH指導(dǎo)原則S7B推薦采用體外試驗篩選候選化合物或受試藥物對HERG通道的作用，從而及時淘汰不適合繼續(xù)開發(fā)的化合物或警示藥品存在心臟毒性風險。本實驗室采用轉(zhuǎn)染人 HERG離子通道的HEK293細胞系測試了三七總皂苷和黃楊寧等傳統(tǒng)中藥或其單體致心臟毒性的潛在風險［15，16］。此外，離體心臟模型、清醒動物遙測等技術(shù)方法也獲得了管理機構(gòu)的認可，很大程度上減少了實驗動物的使用并提高了心臟毒性測試的準確性。

4.3 胚胎干細胞模型

由于胚胎干細胞(ESC)可以在體外無限擴增并保持未分化狀態(tài)，還可定向誘導(dǎo)分化成各種功能細胞，因而在毒性篩選、毒性靶器官的確定以及毒性機制研究等方面具有獨特的巨大優(yōu)勢。作為一種新的毒性測試體外模型，其相關(guān)研究已成為21世紀生命科學領(lǐng)域的熱點和重點課題。英國計劃在2006年～2015年期間投入3000萬英鎊以建立基于ESC的體外毒性評價系統(tǒng)。葛蘭素史克、阿斯利康和羅氏等大型制藥公司也將ESC模型作為藥物毒性篩選的重要策略。人胚胎干細胞(hESC)直接來源于人體，因此其測試結(jié)果具有更好的預(yù)測價值，

最近研究提示人誘導(dǎo)多能干細胞(iPSC)在靶器官毒性評價中具有很好的應(yīng)用價值［17］。

4.4 模式動物斑馬魚

斑馬魚(Danio rerio)是一種與人類基因同源性較高的新型模式動物，其發(fā)育及細胞生物學機制與哺乳動物高度相似，且具有個體小、繁殖周期短、廉價易管理、胚胎透明可以直接觀察器官發(fā)育等優(yōu)點。近年來，斑馬魚已被廣泛用于環(huán)境毒性檢測、藥物早期高通量篩選等毒性測試中。針對斑馬魚在生態(tài)環(huán)境檢測中的應(yīng)用，OECD專門制定了一系列基于斑馬魚的毒性測試操作指南。本實驗室采用斑馬魚評價了氯丙嗪、阿霉素、5-氟尿嘧啶和異煙肼等藥物以及鉛等環(huán)境污染物的毒性作用，均顯示出與哺乳動物有良好的相關(guān)性，后期將開展相關(guān)的驗證試驗以充分證明該模型的可信性和相關(guān)性。

4.5 毒理“組學”

隨著后基因組時代的到來，基因組學、蛋白質(zhì)組學和代謝組學等“組學”技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用為從基因、蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物水平全面系統(tǒng)地開展毒性測試提供了有力的理論支持和方法學支撐，形成了毒理基因組學和毒理蛋白質(zhì)組學等新興交叉學科，為藥物和環(huán)境污染物等化學物的毒性評價提供重要工具。本實驗室采用全基因掃描芯片技術(shù)以及“2D”電泳和飛行質(zhì)譜等蛋白學技術(shù)研究了異煙肼、利福平和阿霉素等藥物以及多氯聯(lián)苯等持久性污染物染毒后的基因表達譜、蛋白質(zhì)組學以及代謝組學改變，為闡明這些毒物的毒性作用特征及其可能的作用機制，制定早期預(yù)測和治療藥物研發(fā)提供了重要參考［18-20］。

5 我國動物實驗替代方法與毒性測試發(fā)展的思考和展望

我國實驗動物替代方法研究起步較晚，與歐美等發(fā)達國家和地區(qū)相比存在較大差距，目前毒性測試仍然以大量的動物實驗為主，以此外推對人體健康的可能危害與風險。近年來，雖然國內(nèi)有些實驗室和學者在替代毒理學領(lǐng)域進行了一些有益嘗試和積極探索，但缺乏系統(tǒng)性的工作，且原創(chuàng)性研究較少，大部分毒理學替代法系參照或追蹤歐盟、美國和日本等國家和地區(qū)的一些方法。我國部分用于藥品、生物制品、化妝品、化學品以及農(nóng)藥等產(chǎn)品的安全性評價的體外檢測技術(shù)方法基本是借鑒了OECD和美國FDA等國際機構(gòu)發(fā)布的技術(shù)指南，這在一定程度上促進了我國實驗動物替代方法的研究和應(yīng)用與國際接軌，并為我國毒性測試體系的發(fā)展起到了積極的促進作用。然而，由于我國尚未建立有關(guān)實驗動物替代方法的專門管理機構(gòu)，國內(nèi)相關(guān)工作呈自由分散狀態(tài)，應(yīng)用監(jiān)管存在缺失甚至空白，缺乏行業(yè)標準與規(guī)范，難以對實驗動物替代方法進行系統(tǒng)的研究、驗證和管理認可以及國際協(xié)調(diào)工作。從事實驗動物替代方法研究的專業(yè)人才短缺，科技投入相對不足，實驗動物替代方法的應(yīng)用與推廣還有限。

值得欣喜的是，近年來實驗動物替代方法研究得到我國政府和學者越來越多的關(guān)注和支持?！笆晃濉逼陂g，在國家科技部和衛(wèi)生部等部門的支持下，我國設(shè)立開展了多項針對食品、藥品和農(nóng)藥等產(chǎn)品安全性評價的體外毒性檢測關(guān)鍵技術(shù)研究。這些項目的開展對于建立形成我國實驗動物替代方法研究體系、推動毒理學替代法在我國健康快速發(fā)展以及專業(yè)人才培養(yǎng)有著十分重要的意義。在國家支撐計劃、“國家重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項和國家自然科學基金等項目的資助下，北京大學、軍事醫(yī)學科學院和中國科學院等國內(nèi)高校和科研院所積極開展了毒理學替代法的相關(guān)研究與推廣。2009年，我國學者出版了第一部有關(guān)替代毒理學的專著，即《毒理學替代法》，此后，還相繼出版了多部實驗動物替代方法相關(guān)專著。已有越來越多的學者和單位積極呼吁我國應(yīng)盡早成立實驗動物替代方法研究和管理的專門機構(gòu)，以規(guī)范我國替代法研究、驗證和管理、加強國內(nèi)外合作與國際協(xié)調(diào)?？梢灶A(yù)見的是，實驗動物替代方法擁有廣闊的發(fā)展前景和應(yīng)用前景，但同時也是我國毒理學和相關(guān)學科工作者面臨的一項任重而道遠的艱巨任務(wù)。

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