朱 華，盧 珊，馮 銘，李 秦，劉 穎，代小偉，安沂華，趙春華，王任直，秦 川

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，

國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所motac合作實(shí)驗(yàn)室，北京 100050；

3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院，北京 1000730；4.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100005；5.北京神經(jīng)外科研究所，北京 100050)

動(dòng)物模型是研究腦血管疾病損傷機(jī)制和防治措施必不可少的工具。評(píng)價(jià)量表在監(jiān)測(cè)臨床腦卒中病情變化、療效判斷、預(yù)測(cè)結(jié)局及大樣本臨床試驗(yàn)研究中起重要作用。目前為止國(guó)際上尚無(wú)一個(gè)公認(rèn)的可用于多中心臨床研究的腦卒中評(píng)定量表，與之相關(guān)的靈長(zhǎng)類腦卒中動(dòng)物模型及神經(jīng)行為評(píng)價(jià)方法更是缺乏，嚴(yán)重影響了臨床科研資料的可比性。針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，在進(jìn)行食蟹猴腦出血模型制作及干細(xì)胞治療的研究過(guò)程中，我們對(duì)目前靈長(zhǎng)類腦卒中模型評(píng)價(jià)中常用的KITO［1］量表進(jìn)行修改和細(xì)化后對(duì)實(shí)驗(yàn)猴的神經(jīng)功能進(jìn)行了動(dòng)態(tài)量化觀察，使其更適于靈長(zhǎng)類腦卒中神經(jīng)功能缺損的評(píng)價(jià)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性食蟹猴12只，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，年齡4～6歲，體重4.2～4.5kg。

1.2 腦出血模型的制作

使用自體股動(dòng)脈抗凝血腦內(nèi)注射方法建立腦出血模型，見(jiàn)參考文獻(xiàn)［2］

1.3 干細(xì)胞治療

1.3.1 動(dòng)物分組：12只動(dòng)物分為模型對(duì)照組、高劑量組、低劑量組，分組的原則是各組動(dòng)物間體重沒(méi)有顯著性差異。各組劑量見(jiàn)下表。

1.3.2 細(xì)胞注射：細(xì)胞為250μL的無(wú)色懸液，2個(gè)移植途徑，每個(gè)移植路徑分3個(gè)點(diǎn)注射，每點(diǎn)移植量為40μL，細(xì)胞數(shù)約6.7×105，移植速度10μL/min。對(duì)照組：等體積生理鹽水。

1.4 神經(jīng)功能評(píng)分

原始評(píng)價(jià)量表來(lái)源于文獻(xiàn)1，在原表格基礎(chǔ)上進(jìn)行細(xì)化修改。其中意識(shí)28分，感覺(jué)系統(tǒng)22分，運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)32分，骨骼肌共濟(jì)協(xié)調(diào)18分共100分。造模后6h，1d，3d，1w及干細(xì)胞注射后1d，3d，1w，2w，3w，4w在每天的固定時(shí)間使用文獻(xiàn)中的表格和改進(jìn)的表格同時(shí)進(jìn)行評(píng)分。表中的“威逼”刺激特指使用鈍頭鋼條輕輕接觸或試圖接觸動(dòng)物。沒(méi)有任何捅、刺、扎、撥、挑等的強(qiáng)制外力施加于動(dòng)物。聲音刺激特指使用鈍頭鋼條輕輕敲擊動(dòng)物籠具發(fā)出的70db左右的金屬碰撞聲。接觸刺激特指使用毛刷輕輕接觸動(dòng)物肌膚。除輕微的掃刷力量外，沒(méi)有其他任何強(qiáng)制外力施加于動(dòng)物。所有評(píng)分由同一名有經(jīng)驗(yàn)的評(píng)價(jià)者完成。

表1 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療食蟹猴腦出血實(shí)驗(yàn)分組Tab.1 The grouping of the animal

表2 改進(jìn)的神經(jīng)功能評(píng)價(jià)表Tab.2 The proved neurological deficit scale

續(xù)表

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，統(tǒng)計(jì)方法采用相關(guān)性分析，單因素方差分析，P＜0.05時(shí)認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果

造模手術(shù)前，所有動(dòng)物的行為表現(xiàn)均正常，神經(jīng)功能評(píng)分為0。造模手術(shù)后6h，動(dòng)物在麻醉蘇醒后均出現(xiàn)了與血腫部位相對(duì)應(yīng)的神經(jīng)系統(tǒng)定位體征。主要表現(xiàn)為有意識(shí)但情緒低落，對(duì)刺激不反抗。受到威逼刺激能夠行走，但攀爬困難。對(duì)腳趾疼痛有弱的、不完全的、不協(xié)調(diào)的收縮反應(yīng)。左前肢出現(xiàn)明顯的麻痹，失去運(yùn)動(dòng)能力。用修改前后的表格評(píng)分均為31分左右。但從術(shù)后24h開(kāi)始出現(xiàn)評(píng)分上的差異。隨著時(shí)間的推移這種差異更加明顯。干細(xì)胞注射前將動(dòng)物進(jìn)行隨機(jī)分組后，用原表格評(píng)價(jià)的分?jǐn)?shù)各組之間雖然沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異，但低劑量組的分?jǐn)?shù)比高劑量組和模型組低且標(biāo)準(zhǔn)差較大。改進(jìn)表格統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)較平均，因此在注射干細(xì)胞后采用改進(jìn)的表格進(jìn)行評(píng)分。結(jié)果顯示干細(xì)胞注射后1周開(kāi)始到動(dòng)物被安樂(lè)時(shí)，劑量組與對(duì)照組之間的神經(jīng)功能評(píng)分出現(xiàn)顯著性差異(p＜0.05)。高、低劑量組間未見(jiàn)顯著性差異。

3 討論

腦卒中臨床神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)在治療預(yù)后評(píng)估方面有很好的參考價(jià)值。臨床醫(yī)師根據(jù)長(zhǎng)期臨床經(jīng)驗(yàn)，提出好的腦卒中評(píng)定量表應(yīng)滿足以下標(biāo)準(zhǔn)［3］：1、量表應(yīng)包括足夠的神經(jīng)功能缺損評(píng)定項(xiàng)目，而且包含的項(xiàng)目對(duì)結(jié)局有預(yù)測(cè)性；2、量表的重測(cè)信度和評(píng)定者間信度好，內(nèi)部一致性好；3、量表應(yīng)敏感，評(píng)分要覆蓋神經(jīng)功能缺損的整個(gè)范圍；4、使用方便，使用者易掌握，整個(gè)評(píng)定時(shí)間最好不超過(guò)14min。為了評(píng)分的可信性應(yīng)該只包括定義明確、容易評(píng)分的項(xiàng)目；但為保持量表整體的敏感性，量表中應(yīng)包括能體現(xiàn)各種腦卒中類型的項(xiàng)目。這兩者之間就存在著矛盾。所以在制訂腦卒中評(píng)定量表時(shí)應(yīng)全面考慮綜合分析。雖然靈長(zhǎng)類動(dòng)物大腦的構(gòu)筑、白質(zhì)與灰質(zhì)的比值及微血管網(wǎng)絡(luò)的分布區(qū)域與人類似，但種系發(fā)生上的差異使評(píng)價(jià)靈長(zhǎng)類動(dòng)物的神經(jīng)功能缺損不能簡(jiǎn)單的平移臨床量表［4，5］?？蓽?zhǔn)確反映靈長(zhǎng)類神經(jīng)功能缺損的量表必須根據(jù)靈長(zhǎng)類動(dòng)物的特點(diǎn)結(jié)合臨床指標(biāo)而設(shè)計(jì)［6］。我們之所以已Kito的表格為基礎(chǔ)進(jìn)行改進(jìn)主要原因有以下幾點(diǎn)：1、評(píng)分表的格式采用的是臨床常用的glasgow昏迷評(píng)分，比較直觀。2、內(nèi)容設(shè)置比較全面合理：評(píng)分包含4各方面：意識(shí)、骨骼肌協(xié)調(diào)、感覺(jué)系統(tǒng)和運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)。其中前3項(xiàng)既與臨床相關(guān)，是臨床評(píng)分表格中的必備項(xiàng)目，又體現(xiàn)了動(dòng)物野外生存應(yīng)對(duì)外界危機(jī)各種刺激的反應(yīng)能力。在運(yùn)動(dòng)功能的檢查項(xiàng)目中，首先是將前后肢分開(kāi)進(jìn)行評(píng)價(jià)，因?yàn)楹锏那爸δ茉谶M(jìn)化過(guò)程中基本獨(dú)立出來(lái)，主要用于抓握和攀爬等，前肢功能損傷會(huì)嚴(yán)重降低動(dòng)物的野外生存能力。另外在每個(gè)分項(xiàng)目均有反映肢體麻痹的內(nèi)容，并把左右前肢分開(kāi)評(píng)價(jià)。我們的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)造模手術(shù)主要影響動(dòng)物對(duì)側(cè)上肢的感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能，同側(cè)則幾乎不受影響。因而把左右前肢分開(kāi)評(píng)價(jià)非常必要。

表3 造模及干細(xì)胞治療前后神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果Tab.3 Neurological deficit score after stroke and human mesenchymal stem cell transplantation

感覺(jué)和反射功能在神經(jīng)功能評(píng)價(jià)中占有很重要的地位，但往往因?yàn)闊o(wú)法準(zhǔn)確檢查而不被包括在檢查項(xiàng)目中。原表格中雖然對(duì)深淺感覺(jué)和各項(xiàng)反射功能進(jìn)行了列項(xiàng)，但評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)比較模糊，而且每個(gè)條目之間分差較大，當(dāng)動(dòng)物癥狀不明顯時(shí)量表的敏感性減低。即損傷程度越輕，改進(jìn)表格與原表評(píng)分結(jié)果之間的差異越顯著。我們的評(píng)分結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)：術(shù)后3d即癥狀最嚴(yán)重的時(shí)期，兩個(gè)評(píng)分表間的差異不顯著。從術(shù)后7 d開(kāi)始兩種評(píng)分方法出現(xiàn)了統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。

改進(jìn)的表格對(duì)原表格所列條目進(jìn)行了逐級(jí)細(xì)化；對(duì)給與動(dòng)物的刺激進(jìn)行分類并對(duì)每種刺激明確定義，使評(píng)價(jià)者易于掌握和準(zhǔn)確打分。這樣即使是神經(jīng)功能的細(xì)微恢復(fù)(如由表現(xiàn)為手指抓握時(shí)持續(xù)翹趾的中度痙攣和無(wú)力到偶爾翹趾的輕度痙攣和無(wú)力)也能表現(xiàn)出來(lái)。而正是這些細(xì)微功能對(duì)于動(dòng)物的整體神經(jīng)功能恢復(fù)評(píng)價(jià)具有重要作用。

靈長(zhǎng)類腦卒中模型能較好的模擬人類腦血管疾病，但因涉及動(dòng)物倫理、實(shí)驗(yàn)成本等原因使用較少，更缺乏標(biāo)準(zhǔn)的模型制作方法和神經(jīng)功能評(píng)價(jià)方法。改進(jìn)的量表在原表格包括運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)和反射功能等信息的基礎(chǔ)上，對(duì)原有條目進(jìn)行細(xì)化和規(guī)范，克服了舊表格中分差大，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)模糊的缺點(diǎn)，即使動(dòng)物的行為學(xué)癥狀不明顯時(shí)也能評(píng)價(jià)出差異，使量表的敏感性大為提高。改進(jìn)的量表可信度增高、可實(shí)施性增強(qiáng)，具有良好的臨床相似性和可操作性。為建立標(biāo)準(zhǔn)化神經(jīng)功能功能評(píng)價(jià)量表進(jìn)行了有益嘗試。

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