趙桂鋒，紀(jì) 蓮，Perry劉

(1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實驗研究中心動物實驗室，沈陽 110003；2.拜耳醫(yī)藥公司，美國，加州)

干細(xì)胞移植廣泛應(yīng)用于大鼠腎臟疾病模型，常見干細(xì)胞移植方法有尾靜脈注入、腎實質(zhì)注入等，近年來很多科研人員將干細(xì)胞經(jīng)腎動脈注入腎臟，但卻由于腎動脈直接穿刺注射后難以止血及造成腎動脈血管內(nèi)膜損傷引起的腎動脈血栓等原因?qū)е聦嶒瀭?cè)腎臟低灌注，甚至失去血供，導(dǎo)致實驗失敗而放棄腎動脈注入干細(xì)胞的例子比比皆是。而尾靜脈注入又不能鎖定靶向器官，顯像差［3］。因此，我們用遠(yuǎn)距離插管，零距離灌注的原則，建立一種簡單易行的腎動脈注入干細(xì)胞的方法。根據(jù)大鼠的心血管解剖結(jié)構(gòu)成功的建立了導(dǎo)管經(jīng)左側(cè)頸動脈直視下介入腎動脈注入干細(xì)胞的方法，簡便易行，手術(shù)時間短，成功率高，值得推廣，本文介紹了該方法的手術(shù)過程和建模體會。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與器械

1.1.1 實驗動物：清潔級 wistar大鼠，體重 180～220g，雌雄不限。由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院醫(yī)學(xué)動物實驗室提供(實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK (京)2009-0004；實驗動物使用許可證號：SYXK (遼)2010-0008)。

1.1.2 器械：顯微直剪刀，眼科剪刀，眼科鑷子，拉鉤。

1.1.3 材料：1-0縫合線，5-0絲結(jié)扎線，PE10導(dǎo)管(外徑0.5mm，內(nèi)徑0.3mm)，尖端剪成75°斜角，尖峰略向內(nèi)彎。肝素生理鹽水、美蘭。

1.2 手術(shù)方法

1.2.1 麻醉：動物術(shù)前禁食8～12h，不禁水，10%水合氯醛，3m L/kg體重腹腔注射。

腹部劍突下1cm處始，向尾端背皮6cm，常規(guī)皮膚消毒，鋪巾展單，沿腹中線分層切口皮膚和腹肌，開窗2cm，生理鹽水溫濕紗布將腸道推開，充分暴露腹主動脈從橫隔膜至左腎動脈分叉處。

1.2.2 頸部腹側(cè)被皮，常規(guī)皮膚消毒后開窗1cm，暴露左頸總動脈，遠(yuǎn)心端永久性結(jié)扎，留牽引線。近心端穿線備用。離結(jié)扎線向近心端2cm處以微動脈夾阻斷血流。頸動脈斜剪一小口，將PE10導(dǎo)管向近心端方向插入至血管夾處，輕度結(jié)扎近心端打活結(jié)，使導(dǎo)管和左頸總動脈輕度結(jié)扎，保證打開血管夾導(dǎo)管入口不漏血。打開血管夾，導(dǎo)管繼續(xù)向主動脈方向插。經(jīng)左側(cè)頸動脈-主動脈弓降部-胸主動脈，進(jìn)入腹腔見圖1圖示。這時用棉簽確認(rèn)導(dǎo)管在腹主動脈中。直視下將導(dǎo)管插至左腎動脈分叉處。用棉簽輕壓腎動脈-腹主動脈分叉處，確認(rèn)導(dǎo)管在腹主動脈里，將左側(cè)腎動脈輕輕拉向右側(cè)直到與腹主動脈平行位，調(diào)整導(dǎo)管頭端插入左腎動脈，根據(jù)實驗要求可以調(diào)整導(dǎo)管插入腎動脈前支、后支及腎上腺動脈，以便將美蘭灌注入腎臟，腎臟迅速變藍(lán)，其他部位沒有任何顏色顯示，證明美蘭已經(jīng)灌入腎臟，沒有灌注到其它臟器。

美蘭灌注完畢，將導(dǎo)管撤出結(jié)扎左側(cè)頸總動脈近心端，腸道復(fù)位，分層縫合腹部肌肉和皮膚及頸部皮膚。

圖1 PE10導(dǎo)管導(dǎo)入腎動脈路徑示意圖Fig.1 Catheter intervention schemes

圖2 大鼠主動脈血管造影圖Fig.2 Aortic imaging figure

圖3 術(shù)后5d左腎動脈Fig.3 Pathological change of renal atery 5days postoperation

2 結(jié)果

大鼠手術(shù)16只，術(shù)后死亡2只，死亡原因系麻醉過程中大鼠體溫過低所致。

術(shù)后5d取材7只觀察腎動脈血栓形成情況，未發(fā)現(xiàn)血栓形成(圖 3)，剩余成活 7只(30d以上)。

3 討論

大鼠的腎臟給藥方法一般采用注射器直接穿刺注射，術(shù)后針孔難以止血，而且容易引起血管內(nèi)膜損傷形成血栓、梗阻等現(xiàn)象從而引起給藥靶器官血缺血，直接影響實驗結(jié)果。PE10導(dǎo)管外徑0.5mm，內(nèi)徑0.3mm，表面光滑，不易損傷血管內(nèi)膜，適用于細(xì)小血管的插管操作。PE10導(dǎo)管導(dǎo)入路徑：左側(cè)頸總動脈-主動脈弓降部-胸主動脈-腹主動脈-腎動脈(圖1)。主動脈弓上分出三支動脈分別為：無名動脈、左頸總動脈和左鎖骨下動脈，左頸總動脈起始端位于主動脈弓降部，胸主動脈自主動脈開始，延伸到膈為止其分支有肋間動脈、肋下動脈、隔上動脈。腹主動脈至左腎動脈之間的主要分支有膈下動脈、腹腔動脈、腸系膜前動脈等［4］，經(jīng)大鼠心臟全身動脈造影［5］顯示這些分支均與胸主動脈及腹主動脈成一定角度，且管徑均在1mm以下，自左頸總動脈-主動脈弓-胸主動脈-腹主動脈基本成一條直線(圖2)，所以當(dāng)PE10導(dǎo)管經(jīng)左側(cè)頸總動脈導(dǎo)入至腹主動脈-腎動脈分叉處時，能夠順利的到達(dá)。PE10導(dǎo)管經(jīng)大鼠左側(cè)頸動脈直視介入腎動脈給藥法優(yōu)點：①直視下操作，簡單易行，成功率高；手術(shù)時間短(25±5m in)。②左側(cè)頸動脈起自主動脈降部，導(dǎo)管一般可順利直接進(jìn)入胸主動脈-腹主動脈。③PE10導(dǎo)管外徑較胸主動脈和腹主動脈細(xì)很多，對血流影響小，且導(dǎo)管外表光滑，導(dǎo)入過程很少造成因血管內(nèi)皮損傷而引起血栓。本實驗存活大鼠23只，為期30d沒有發(fā)現(xiàn)主動脈和腎動脈血栓形成。④導(dǎo)管進(jìn)入腹主動脈后，輕壓腹主動脈減少血流即可見血管內(nèi)PE10導(dǎo)管，可以明確判斷導(dǎo)管頭端位置?？紤]到大鼠的左頸總動脈起始位置的個體差異，雖不常見，也需有對應(yīng)措施。個別大鼠左頸總動脈起始于主動脈弓的頂端，導(dǎo)管有可能偏右進(jìn)入升主動脈甚至進(jìn)入左心室。為保持導(dǎo)管貼主動脈左側(cè)下行，需把導(dǎo)管頂端剪成75°，斜面向右。導(dǎo)管從盤繞狀態(tài)截下后，一般保持直徑20cm左右的弧度。不必調(diào)整成筆者的導(dǎo)管。標(biāo)記彎曲面，插管時保持弓面向右，曲面向左。導(dǎo)管進(jìn)入主動脈弓時必然向左進(jìn)入胸主動脈。

為避免有斜面頂端的導(dǎo)管損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)管尖端使用前做預(yù)處理。運用剪管技巧，可以使頂端的尖峰向內(nèi)偏斜，下行時就可以避免尖峰觸及血管內(nèi)皮了。

本方法的基本灌注原則是遠(yuǎn)距離進(jìn)入血管，零距離靶器官灌注。把因灌注帶給靶器官的物理損傷降低到最小。本著這個原則，經(jīng)頸動脈插管，還可以用于其它腹腔臟器的灌注［1-2］。甚至做后肢灌注時，無需在腹部或后肢切開皮膚，直接觸及皮下，就可知導(dǎo)管到達(dá)位置。有些單器官灌注亦可從股動脈逆行插管，到達(dá)靶向器官灌注。因為血管解剖位置的原因。某些器官的灌注，沒有熟練的技術(shù)，從股動脈插管進(jìn)行灌注導(dǎo)管導(dǎo)入比較困難。做股動脈插管，PE10略粗一點，可以先拉細(xì)后再用。有些模型需要保持大腦的正常血流，可以用頸外動脈插管代替頸總動脈插管。

本方法也可以用于埋管，長期給藥。長期埋管用硅膠管代替PE管，具有避免排異反應(yīng)的好處，而且柔軟，對機體損傷小。但是正是由于太軟，不適于遠(yuǎn)距離插管操作。遠(yuǎn)距離插管，局部給藥，還可以用于x光檢查時灌注局部顯影指示劑。

總之，以經(jīng)大鼠左側(cè)頸總動脈介入腎動脈灌注法為代表的遠(yuǎn)距離插管，零距離灌注的方法簡便易行，成功率高，灌注位置準(zhǔn)確，灌注量精確，對靶向器官損傷小。值得推廣普遍使用。

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