楊豐榕，蘇 強(qiáng)，李瑞燕，高建平

山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山西太原 030001

中藥黨參（Radix Codonopsis）用于脾肺虛弱，氣短心悸，食少便溏，虛喘咳嗽，內(nèi)熱消咳[1]。產(chǎn)于山西長治的潞黨參[Codonopsis pilosula（Franch）Nannf.]，質(zhì)量悠久、品質(zhì)好，為道地藥材。黨參主要含有多糖、皂苷、甾醇、三萜、生物堿、倍半萜及香豆素類成分等[1]，其中多糖含量最大。現(xiàn)代藥理研究表明，黨參多糖在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抗衰老、抗缺氧、抗應(yīng)激、抗氧化等多個方面具有較好的生物活性[2-6]。多糖的功效與其結(jié)構(gòu)和組成有著密切的關(guān)系[7]，多糖結(jié)構(gòu)研究的重要環(huán)節(jié)是對其單糖組成及物質(zhì)的量之比的分析。本文以產(chǎn)于山西長治的潞黨參為材料，提取黨參總多糖并進(jìn)行分離純化及單糖組成分析，以期得到新的黨參多糖，為開展藥效學(xué)等研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

waters 515 HPLC pump，日本島津GCMS-QP2010分析儀。

黨參總多糖（自制），D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-阿拉伯糖、D-半乳糖，D-木糖、L-鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸，標(biāo)準(zhǔn)分子量多糖Dextran 180、Dextran 2500、Dextran 4600、Dextran 7100、Dextran 10000、Dextran 21400、Dextran 41100、Dextran 84400、Dextran 133800、Dextran 2000000（中國藥品與生物制品檢定所產(chǎn)品）；纖維素DE-52（whatman進(jìn)口分裝）。

2 方法與結(jié)果

2.1 黨參總多糖的制備

依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已獲得的專利方法[8]制備黨參總多糖。

2.2 纖維素柱色譜洗脫

取黨參總多糖0.5 g溶于10 ml水中，4 000 r/min離心15 min，取上清液上樣。100 g DE-52纖維素裝柱；蒸餾水、0.05 mol/L NaCl、0.10 mol/L NaCl、0.15 mol/L NaCl、0.25 mol/L NaCl溶液梯度洗脫；體積流量1 ml/min；苯酚-硫酸法沸水反應(yīng)15 min后紫外分光光度計490 nm檢測。合并單一峰，得到5個洗脫組分。取0.10 mol/L、0.15 mol/L NaCl溶液洗脫組分，蒸餾水透析至無 Cl-，40℃真空干燥后得到 CPS’-3、CPS’-4，2個黨參多糖。

2.3 高效凝膠滲透色譜法檢測黨參多糖亞級分純度及分子量的測定

色譜條件：泵：waters 515 HPLC pump；工作站：Millennium32；檢測器：waters 2410 RID；柱子：TSK GMPWXL；檢測器溫度：35℃；柱溫：35℃；流速：0.3 ml/min；流動相：超純水。

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品保留時間-分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線制定 取多糖標(biāo)準(zhǔn)品分別用蒸餾水配成20 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每次進(jìn)樣20 μl，流動相為超純水，流速0.3 ml/min，測得各標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間。以保留時間tR為橫坐標(biāo)，分子量的對數(shù)lgMw為縱坐標(biāo)，得到分子量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為：Y=－0.289 2X+12.163（r=0.999 2），分子量在 2 500～133 800 之間與保留時間tR線性關(guān)系良好。

2.3.2 多糖樣品分子量測定 分別稱取黨參多糖分離組分CPS’-3、CPS’-4 適量，蒸餾水配制成 20 mg/ml的溶液，每次進(jìn)樣20 μl，流動相為超純水，流速0.3 ml/min，測各樣品的保留時間。結(jié)果見圖1～2。

2.3.3 結(jié)果 CPS’-3 分子量為 1.15×105、CPS’-4 分子量為200萬以上。

2.4 黨參多糖的單糖組成分析

2.4.1 多糖的水解 取分子量均一的多糖樣品CPS’-3、CPS’-4各30 mg，加入2 moL/L的三氟乙酸 2 ml，封管，100℃水解12 h，取出后N2吹干，備用。

2.4.2 氣相-質(zhì)譜聯(lián)用色譜分析 采用糖腈乙酰法制備衍生物：分別稱取標(biāo)準(zhǔn)單糖和多糖樣品水解后的糖樣各10 mg，加入鹽酸羥胺10 mg，內(nèi)標(biāo)肌醇7 mg和吡啶0.5 ml，于90℃水浴加熱30 min并振蕩，取出冷卻至室溫，加入醋酸酐0.5 ml，在85℃繼續(xù)加熱30 min進(jìn)行乙酰化，產(chǎn)物濃縮至干，加入0.5 ml氯仿溶解，溶液經(jīng) 0.45 μm 濾膜過濾后，0.2 μl進(jìn)樣，氣相色譜儀進(jìn)行分析。

色譜條件：SE30彈性石英毛細(xì)管色譜柱；檢測器：氫火焰離子化檢測器（FID）；程序升溫：120℃（5℃/min）～240℃（5 min）；汽化溫度 280℃ ；檢測器 280℃；載氣：高純氮?dú)狻?結(jié)果見圖 3～10。

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)單糖相對校正因子測定精確稱取各個標(biāo)準(zhǔn)單糖，以“2.4.2”的方法進(jìn)行衍生化，制備糖腈乙?；苌?，進(jìn)行GC-MS分析，并求出定量校正因子f。

（Wi標(biāo)準(zhǔn)單糖質(zhì)量；Ws內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量；Ai標(biāo)準(zhǔn)單糖峰面積；As內(nèi)標(biāo)物峰面積）

2.4.4 多糖中各單糖物質(zhì)的量之比的計算 由以下公式求得各單糖物質(zhì)的量，進(jìn)而求出它們物質(zhì)的量之比。

（N單糖物質(zhì)的量；Ax單糖峰面積；As內(nèi)標(biāo)物峰面積；f該單糖的校正因子；Mr該單糖的分子量）

2.4.5 結(jié)果 CPS’-3由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖組成，其摩爾比為 1.5∶2.7∶4.6；CPS’-4 由鼠李糖、 阿拉伯糖、 半乳糖組成，其摩爾比為 1.3∶0.9∶2.6。

3 討論

氣相和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）是目前國際上分析糖類的有效手段，可以同時獲得單糖衍生物的保留時間和質(zhì)譜信號，以時間和質(zhì)譜信號進(jìn)行雙重定性，能夠快速準(zhǔn)確地測出多糖的組成以及各單糖之間的摩爾比，結(jié)果更可靠[8-9]。據(jù)文獻(xiàn)報道，張雅君等[10]在黨參中發(fā)現(xiàn)1個分子量為1.06×106的多糖，利用氣相色譜法（GC）分析后可知該黨參多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖組成，摩爾比為1∶1.12∶1.13；任麗靖等[11]同樣利用GC法分析在黨參中發(fā)現(xiàn)的1個多糖，該多糖由阿拉伯糖、核糖、甘露糖、果糖、半乳糖、葡萄糖及一個未知單糖組成。本文利用DE-52纖維素分離得到了2個黨參多糖，分子量為1.15×105的CPS’-3，分子量為200萬以上的CPS’-4，通過GC-MS法分析多糖的單糖組成及其摩爾比，與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖比較后，能夠確認(rèn)氣相圖譜中每個單糖峰所代表的單糖種類，最終確證CPS’-3、CPS’-4均由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖組成，摩爾比分別為1.5∶2.7∶4.6和1.3∶0.9∶2.6，與文獻(xiàn)報道的均不相同，是新發(fā)現(xiàn)的黨參多糖。

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