何清湖，周 興

（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院男性病科，湖南 長沙 410007）

環(huán)磷酰胺復制中老年男性雄激素部分缺乏綜合征大鼠模型的研究

何清湖1，周 興2

（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院男性病科，湖南 長沙 410007）

目的 應用環(huán)磷酰胺復制中老年男性雄激素部分缺乏綜合征的大鼠模型建立。方法 取20只大鼠隨機分為2組：正常組，模型組。分別于造模前、造模后1 d、造模后30 d觀察大鼠一般情況、體質(zhì)量、懸尾實驗和強迫游泳實驗時間以及睪丸指數(shù)，放射免疫法測定各組造模前后血清TT、FT水平，免疫組化法測定各組大鼠睪丸間質(zhì)細胞stAR蛋白平均灰度值，并進行統(tǒng)計分析。結果 與正常組比較，模型組大鼠懸尾實驗時間延長，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），強迫游泳實驗時間縮短，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），血清TT、FT水平、stAR蛋白平均灰度值均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論 環(huán)磷酰胺造成的大鼠血清TT、FT水平下降，行為學改變的反睪丸組織退行性變，基本類似PADAM模型。

中老年男性雄激素部分缺乏綜合征；環(huán)磷酰胺；動物模型；大鼠

中老年男性雄激素部分缺乏綜合征（partial androgen deficiency of aging male，PADAM）， 是指中老年男性隨著年齡的增長體內(nèi)雄激素合成功能逐步衰退，出現(xiàn)以生殖生理和植物神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂為主的癥候群，主要表現(xiàn)為性欲減低、勃起障礙、疲乏、精力不集中、甚至抑郁、焦慮、煩躁易怒等一系列臨床綜合征，嚴重地影響了患者的健康與工作。有關該病病因及發(fā)病機制的探索、治療方法的評價和新藥的研發(fā)在很大程度上需要通過動物實驗進行，因此PADAM動物模型的研制顯得尤為重要。本文試圖以環(huán)磷酰胺造成大鼠生殖系統(tǒng)受損、雄激素部分缺乏，從而復制出PADAM大鼠模型，為PADAM的深入研究提供一個新的途徑。現(xiàn)將實驗方法及結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級SD雄性大鼠，6月齡，體質(zhì)量（200±20）g，20只。由中南大學湘雅醫(yī)學院實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（湘）-2006-0002。

1.1.2 藥物 環(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，0.2 g/瓶，批準文號：國藥準字 H32020857。

1.1.3 儀器 石蠟切片機、光學顯微鏡、微量電子天平等均由湖南中醫(yī)藥大學病理教研室提供。

1.1.4 試劑 血清總睪酮（TT）放射免疫試劑盒，批號：E0458r；游離睪酮（FT）放射免疫試劑盒，批號：E0457r；類固醇合成快速調(diào)節(jié)蛋白（stAR蛋白）免疫組化試劑盒，批號：M6691m-h；均由武漢中美科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 按隨機原則，分為2組并編號：正常組（10 只），模型組（10 只）。

1.2.2 造模 參考章振寶[1-2]、張培海[3]等的造模方法。模型組予腹腔注射環(huán)磷酰胺，20 mg/（kg·d），正常組予腹腔注射與模型組等體積的生理鹽水，連續(xù)5 d。

1.2.3 一般情況觀察 包括大鼠毛色，精神狀態(tài)，活動情況、體質(zhì)量等；睪丸及睪丸指數(shù)。

睪丸指數(shù)=雙側睪丸質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%

1.2.4 大鼠懸尾實驗 本實驗于環(huán)磷酰胺造模前1天、造模后第1天、第30天進行。將大鼠尾端2 cm的部位固定在同一水平木板上 (木板離地1 m左右)，使動物呈倒掛狀。懸掛兩側用板隔開動物視線，動物為克服不正常的體位而掙扎活動，但活動一定時間后，出現(xiàn)間斷性“不動”，顯示“失望”狀態(tài)。計算6 min內(nèi)的不動時間，并同時觀察大鼠掙扎幅度及抑郁狀態(tài)。此實驗能一定程度地反映動物的肌力及抑郁程度。

1.2.5 大鼠強迫游泳實驗 本實驗在實驗結束當天進行。以實驗室洗手池作為游泳池，規(guī)格為100 cm×60 cm×85 cm，游泳時水深為60 cm，大鼠不能以尾撐池底休息，水溫(25±1)℃。將大鼠置入游泳池，分別記錄大鼠從入水到游泳至力竭的時間。本實驗參照Mcardle[4]推薦的力竭判斷標準，即游泳最后下沉，經(jīng)10 s后仍不能返回水面為力竭。常溫下游泳至力竭的時間是反映動物體力及衡量動物是否疲勞的經(jīng)典指標。

1.2.6 睪丸組織形態(tài)學觀察 采用HE染色，光鏡下觀察睪丸組織形態(tài)。

1.2.7 血清TT、FT 采用放射免疫法。

1.2.8 stAR蛋白陽性率 采用免疫組化法。

1.2.9 形態(tài)計量分析 利用MIAS-300型圖像分析系統(tǒng)，分別測定免疫組化染色陽性反應物的灰度值以反應各組標本產(chǎn)物的相對含量，每例隨機選樣10個高倍視野，約100個細胞的平均灰度值，則反映該例平均灰度值，它是用來表示圖像透光率的參數(shù)，與免疫組化陽性表達成反比。若細胞內(nèi)陽性反應產(chǎn)物濃度越高，透光率低，則灰度值越低，反之則越大。

1.3 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)以SPSS 14.0統(tǒng)計軟件包處理，采用t檢驗，用“”表示，以 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 對兩組大鼠一般情況的影響

正常組：大鼠一般情況良好，運動活潑有力，反應敏捷，眼睛明亮有神，食欲健旺，鼠毛柔順濃密，潔凈有光澤，肌肉發(fā)達，脂肪豐滿，體質(zhì)量均勻增長。模型組：大鼠一般情況較差，萎靡倦臥少動，甚者蜷縮至墊料下面，眼睛暗淡少神，進食減少，鼠毛枯干蓬亂萎黃，污濁無光澤，體質(zhì)量無明顯增長。

2.2 對兩組大鼠體質(zhì)量及睪丸指數(shù)的影響

造模前，兩組大鼠體質(zhì)量比較，無統(tǒng)計學意義（P＞0.1），具有可比性。 造模后 1、30 d，兩組大鼠體質(zhì)量比較均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示環(huán)磷酰胺能減輕大鼠體質(zhì)量。與正常組比較，睪丸指數(shù)顯著降低（P＜0.01）。 結果見表 1。

表1 對兩組大鼠體質(zhì)量及睪丸指數(shù)的影響（，g，n=10）

表1 對兩組大鼠體質(zhì)量及睪丸指數(shù)的影響（，g，n=10）

注：與正常組比較▲P＜0.01。下表同。

組 別正常組模型組造模前210.32±14.896 209.63±17.341造模后1 d 225.4±17.765 212.5±20.430▲造模后30 d 281.8±11.234 180.0±3.553▲睪丸指數(shù)1.66±0.117 1.17±0.115▲

2.3 對兩組大鼠行為學改變的影響

兩組大鼠造模前懸尾時間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），具有可比性。造模后1 d、30 d，懸尾時間和游泳時間分別與正常組比較，均存在顯著差異（P＜0.01）。結果見表2。

表2 兩組大鼠懸尾實驗及強迫游泳實驗時間比較 （，n=10）

表2 兩組大鼠懸尾實驗及強迫游泳實驗時間比較 （，n=10）

組 別正常組模型組懸尾實驗（s）造模前 造模后1 d 造模后30 d 171.25±17.389 169.62±16.625 164.81±6.509 172.77±15.213 186.86±23.469▲ 191.69±10.929▲強迫游泳實驗(min)28.04±6.071 20.07±9.765▲

2.4 對兩組大鼠血清TT、FT水平，stAR蛋白平均灰度值的影響

兩組大鼠造模前TT、FT水平無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），具有可比性。造模后第1天、第30天，TT、FT水平分別與正常組比較，均差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。模型組stAR蛋白平均灰度值比較，明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結果見表3、4，見圖 1。

表3 兩組大鼠血清TT水平比較 （，ng/dL，n=10）

表3 兩組大鼠血清TT水平比較 （，ng/dL，n=10）

組 別正常組模型組造模前183.453±32.343 184.997±28.550造模后1 d 185.253±30.453 59.834±18.242▲造模后30 d 190.430±24.629 59.930±20.523▲

表4 兩組大鼠血清FT水平及stAR蛋白平均灰度值比較 （，ng/dL，n=10）

表4 兩組大鼠血清FT水平及stAR蛋白平均灰度值比較 （，ng/dL，n=10）

組 別正常組模型組造模前3.562±1.275 3.633±0.986造模后1 d 3.750±1.038 1.601±0.753▲造模后30 d 3.881±0.994 1.420±0.651▲stAR蛋白平均灰度值0.146±0.053 0.266±0.109▲

圖1 兩組大鼠睪丸組織形態(tài)學光鏡圖（HE染色×400）及stAR蛋白免疫組化（×400）

3 討論

目前用于PADAM研究的動物模型較少，主要是采用自然老化的更年期大鼠模型。一般用20～24月齡的大鼠，該模型與PADAM的生物學特性較為接近，然而出于經(jīng)濟利益的考慮，大多數(shù)實驗動物中心不太可能將雄性大鼠白白飼養(yǎng)兩年后再出售，因此這種自然老化的更年期大鼠來源非常稀少。那么，如何復制出一種方便、可行、經(jīng)濟、實用的PADAM動物模型顯得尤為重要。

郭應祿[5]等認為PADAM的發(fā)生與發(fā)展，包含有眾多的激素水平改變、許多相關的疾病、精神心理、環(huán)境及其他因素的影響，但雄激素（睪酮）的部分缺乏是PADAM的最重要原因之一。因此以睪酮作為檢驗本模型的關鍵性指標。睪酮的合成是以膽固醇為原料，在睪丸間質(zhì)細胞進行（約占95%），在這一過程中，膽固醇進入線粒體內(nèi)膜 (由StAR蛋白完成)、膽固醇裂解為孕烯醇酮(由P450scc催化)、孕烯醇酮變成孕酮(由3β-HSD催化)，這3個反應構成了睪酮合成的限速步驟[6-8]。

大量研究證實，環(huán)磷酸胺具有生殖毒性。主要表現(xiàn)在：睪丸損傷[9]、生精功能障礙[10-12]、染色體畸變[13]、睪酮合成障礙[14]等。本實驗以環(huán)磷酰胺生殖毒性為基礎，依據(jù)章振保[1-2]、張培海[3]等的造模方法，應用環(huán)磷酰胺造模后，與正常組比較，模型組大鼠出現(xiàn)了體質(zhì)量減輕，活動減少，毛發(fā)卷曲發(fā)黃干枯無光澤，血清TT、FT（血清TT水平不完全能夠反映生物活性睪酮的水平，所以實驗中同時增加了對FT水平的檢測）水平下降（P<0.01），行為學（懸尾試驗和強迫游泳實驗）部分改變，睪丸系數(shù)顯著降低以及睪丸組織HE染色（見圖A1、A2）示睪丸曲精小管直徑縮小、間距增寬、生精上皮變薄、結締組織增生、生精細胞和間質(zhì)細胞數(shù)目減少等退行性變化，基本類似PADAM，說明應用環(huán)磷酰胺復制PADAM動物模型是可行的。

Ujjal B.D[15]等推測，其機制可能與環(huán)磷酰胺顯著抑制睪丸間質(zhì)細胞內(nèi) 3β-HSD、17β-HSD的活性，引起睪酮合成障礙，血清T水平下降有關。本實驗研究顯示，模型組stAR蛋白平均灰度值（見圖B1、B2）明顯升高，因此環(huán)磷酰胺降低血清T水平可能還與影響stAR活性有關。它是否通過調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-睪丸生殖軸或其他的途徑，仍有待進一步研究。本研究的模型動物仍有低水平的T分泌，這與自然造模法以及臨床實際相接近，且與自然造模法相比更為經(jīng)濟實用。但本模型也有一些不足之處，如臨床常見的烘熱汗出、心悸失眠、憂郁健忘、頭暈、腰酸等癥狀在動物身上較難觀察，這些癥狀大多與自主神經(jīng)功能紊亂、中樞神經(jīng)遞質(zhì)的變化有關。

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（本文編輯 彭芝配）

Study of partial and rogen deficiency model induced by cyclophosphamide in rats

HE Qing-hu,ZHOU Xing
(TCM University of Hunan,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To reproduce the partial and rogen deficiency model using cyclophosphamide （CP） in rats.Methods 20 ratswere divided randomly into normal control group(N)and model group(M).Before modeling and after modeling 1 day and 30 days,all the rats were measured their general situation and weight,observed in tail suspension experiment and exhaustion swimming test and their testicular index,and evaluated their status,serum TT and FT level were detected with radiation immune measuring,and leydig cell stAR with immunohistochemical.Result Compared with N,the tail suspension test time in M was longer（P＜0.01） and exhaustion swimming time shorter（P＜0.01）;the serum TT and FT level and expression level of leydig cell stAR protein decreased(P＜0.05).Conclusion The serum TT and FT level to decline rats by CP is similar to clinical PADAM.

partial androgen deficiency of aging male（PADAM）;cyclophosphamide（CP）;animal model;rats

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2011.01.004.015.03

2010－07－07

國家自然科學基金項目（30973759/H2709）；湖南省自然科學基金項目（09JJ3054）。

何清湖（1965-），男，湖南耒陽人，教授，醫(yī)學博士，博士研究生導師，主要從事中西醫(yī)結合男性病、生殖亞健康研究。

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