張亞男

(泰山學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)系，山東 泰安 271021)

多糖是生物有機(jī)體內(nèi)普遍存在的一類生物大分子，既以游離的形式參與生命過程，又與蛋白質(zhì)、肽及脂質(zhì)等組成聚合物的形式;它不僅參與組織細(xì)胞骨架的構(gòu)成，而且是多種內(nèi)源性生物活性分子的重要組成成分;它在生理機(jī)能的平衡與穩(wěn)定過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)廣泛參與細(xì)胞的各種生命活動而產(chǎn)生多種生物學(xué)功能［1－2］.某些植物多糖特別是其修飾物具有抗血栓、調(diào)節(jié)血脂、抗腫瘤、抗病毒、增強(qiáng)細(xì)胞免疫和機(jī)體免疫功能、抗氧化、對機(jī)體細(xì)胞的保護(hù)等作用［3－10］.活性多糖的研究已成為當(dāng)今研究的一個(gè)熱點(diǎn)，它的重要特征是在多糖鏈上具有硫酸基，而且其活性與分子中硫酸基的含量有著直接關(guān)系，硫酸基含量越高，其抗HIV病毒的作用越強(qiáng)［11］.因此，準(zhǔn)確測定硫酸基含量是十分重要的.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

紫外分光光度計(jì)，PHAMACIA UV2000.

硫酸基標(biāo)準(zhǔn)儲備液:精密稱取105℃干燥至恒質(zhì)量的Na2SO488.6 mg溶于1mol/L的鹽酸中(SO24－濃度為0.6 mg/mL);明膠:分別配制成0.25%、0.50%、0.75%的溶液，冷藏保存;氯化鋇:1 g氯化鋇溶于100 mL明膠溶液中;三氯乙酸:2%、3%、5%的水溶液.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

通過鹽酸水解從皂角多糖修飾物中釋放硫酸基，與BaCl2生成硫酸鋇，SO24－含量與其吸光度呈線性關(guān)系，用分光光度計(jì)在360nm處，測定其吸光度值，計(jì)算出硫酸基的含量.以線性關(guān)系相關(guān)系數(shù)和回收率為指標(biāo)考察試劑用量和水解條件對檢測方法的影響，確定最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件，確定硫酸鋇比濁法檢測皂角多糖硫酸基含量的準(zhǔn)確性.

1.2.1 皂角多糖修飾物樣品(以下簡稱樣品)的處理

稱取樣品100 mg，用1 mol/L HCl溶液(鹽酸濃度為考察條件之一)溶解，于100℃水浴中水解，冷卻后，加鹽酸溶液補(bǔ)至刻度線，用濾紙過濾，除去不溶物質(zhì)，即得粗樣品，保存?zhèn)溆?

1.2.2 紫外光譜的測定

取Na2SO4標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液各0.2 mL，加三氯乙酸溶液3.8 mL和氯化鋇溶液1mL，將其混勻，進(jìn)行紫外光譜測定.結(jié)果表明，Na2SO4和樣品均在360nm處有最大吸收峰.

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)Na2SO4標(biāo)準(zhǔn)溶液0.02mL，0.06mL，0.08mL，0.10mL，0.12mL，0.14mL，0.16mL，0.20mL，以鹽酸溶液補(bǔ)至0.2mL，以0.2 mLHCl溶液作為空白，加入三氯乙酸3.8 mL及氯化鋇溶液1.0 mL，搖勻，室溫靜置15 min，于360 nm測吸光度A1;以1.0 mL明膠溶液代替氯化鋇溶液，測吸收度A2;以硫酸基質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度(A1－A2)為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定線性范圍及線性關(guān)系.其中每點(diǎn)做三個(gè)平行樣品，取平均值.

1.2.4 回收率試驗(yàn)

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備液和樣品溶液按比例搖勻，取0.15ml按硫酸基含量測定方法測定SO2－4含量，計(jì)算回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%［12］.

2 結(jié)果與討論

2.1 明膠濃度的影響

通過繪制Na2SO4與不同濃度明膠混合反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線并且測定回收率，考察明膠濃度對線性關(guān)系的影響［13－14］，確定硫酸比濁法中適宜的明膠濃度.

按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法操作，控制C(SO2－4)在0～60μg/ml(HCl補(bǔ)足至0.5 ml)，3%三氯乙酸加入量3.5ml，分別用0%(超純水代替)、0.25%、0.5%、0.75%的明膠配制的1%的BaCl2加入量1ml.標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測結(jié)果見表1，不同濃度明膠的回收率結(jié)果見表2.

表1 不同明膠濃度的線性關(guān)系考察結(jié)果

表2 不同濃度明膠的回收率

由表1可以看出明膠濃度對線性關(guān)系影響很小，去除相關(guān)系數(shù)最小的0%的明膠，其他濃度范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R都高于0.994.用回收率考察明膠的影響結(jié)果(表2)可以看出0.25%的明膠線性關(guān)系雖然很好，但是平均回收率非常低.明膠濃度為0.5%和0.75%的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系和回收率都比較好，其中明膠濃度為0.5%時(shí)平均回收率為98.47%，RSD%為3.42%;明膠濃度為0.75%時(shí)平均回收率為100.97%，RSD%為4.33%，綜合看明膠濃度為0.75%時(shí)測得的回收率更好，故適宜的明膠濃度為0.75%.

2.2 三氯乙酸濃度的影響

取0.75%的明膠作為溶劑配制1%的BaCl2.控制三氯乙酸加入量3.5ml，1%的BaCl2加入量1 ml的條件下，考察不同濃度三氯乙酸對線性關(guān)系的影響，操作步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，不同濃度三氯乙酸的回收率結(jié)果見表4.

表3 不同三氯乙酸濃度的線性關(guān)系考察結(jié)果

表4 不同濃度三氯乙酸下的回收率

由表3可以看出三氯乙酸濃度對線性關(guān)系影響很小，三氯乙酸濃度0%～5%范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)都高于0.99.由表4可以看出三氯乙酸濃度為0%和2%時(shí)回收率較低，三氯乙酸濃度為3%時(shí)回收率的平均值為98.47%，RSD%為6.52%，三氯乙酸濃度為5%時(shí)回收率的平均值為101.59%，RSD%為9.35%，結(jié)合兩者看出3%的三氯乙酸測定結(jié)果更好，因此測定過程中三氯乙酸濃度宜為3%.

2.3 水解時(shí)間對檢測結(jié)果的影響

選取三氯乙酸濃度為3%，明膠濃度為0.75%，按標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行操作.稱取的微量樣品用1molHCl以1mg/ml溶解好之后，放進(jìn)超級恒溫器水解，控制水解溫度100℃，取出不同時(shí)間的樣品溶液測吸光度，并分別計(jì)算硫酸基質(zhì)量濃度C(SO2－4)、硫的質(zhì)量濃度Cs及硫的質(zhì)量百分含量s%，以s%為指標(biāo)，考察水解時(shí)間對檢測結(jié)果的影響，測定結(jié)果見表5、圖1.

表5 水解時(shí)間對檢測結(jié)果的影響

圖1 水解時(shí)間對檢測結(jié)果的影響

由表5和圖1可以看出在加熱水解180分鐘時(shí)，吸光度和硫的質(zhì)量百分含量S%測定值最高，說明在180分鐘時(shí)樣品水解完全，硫酸根游離出來，而水解時(shí)間過長時(shí)可能會導(dǎo)致反應(yīng)系統(tǒng)發(fā)生一些變化影響檢測結(jié)果，所以水解時(shí)間宜控制180分鐘，水解條件確定為100℃、3小時(shí).

2.4 水解時(shí)鹽酸濃度對檢測結(jié)果的影響

保持樣品溶液質(zhì)量濃度為1mg/mlHCl，改變鹽酸濃度，檢測用不同濃度鹽酸溶解的樣品在水解條件為100℃、3小時(shí)下的吸光度，并分別計(jì)算硫酸基質(zhì)量濃度C(SO2－4)、硫的質(zhì)量濃度Cs及硫質(zhì)量百分含量s%，以s%為指標(biāo)，確定適宜的鹽酸濃度.

為了使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確，應(yīng)消除鹽酸中可能含有的硫的影響，以及考慮在加熱過程中鹽酸易揮發(fā)特性的影響，將未加入樣品的鹽酸管與加入樣品的鹽酸管一同在100℃下水解三小時(shí)，以便使兩者鹽酸的揮發(fā)量比較相近，空白與待測樣品測定時(shí)濃度較一致，使測量值更準(zhǔn)確.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6.

表6 鹽酸濃度對檢測結(jié)果的影響

由表6可以看出，鹽酸濃度在0.8～1.4mol/L之間時(shí)s%較大并且穩(wěn)定，說明在此條件多糖完全水解，過高的鹽酸濃度1.6mol會影響檢測結(jié)果，因此較適宜的鹽酸濃度是0.8～1.4mol/L，為了方便起見選擇濃度為1mol/L的鹽酸溶解樣品，進(jìn)行水解.

2.5 水解時(shí)鹽酸用量對檢測結(jié)果的影響

保持樣品用1mol/L的HCl溶解，改變鹽酸的用量，檢測不同質(zhì)量濃度的樣品在相同水解條件為100℃、3小時(shí)下的吸光度，計(jì)算硫的質(zhì)量百分含量s%.以s%為指標(biāo)，考察鹽酸用量對檢測結(jié)果的影響.同2.4操作步驟，將未加入樣品的鹽酸管與加入樣品的鹽酸管一同在100℃下水解三小時(shí)，測量結(jié)果見表7.

表7 鹽酸用量對檢測結(jié)果的影響

由表7可以看出，鹽酸用量在4～6ml之間時(shí)s%較穩(wěn)定，說明此時(shí)多糖完全水解，硫酸根游離出來，而鹽酸用量較高時(shí)會影響測定結(jié)果.所以選擇用5ml鹽酸溶解樣品去加熱水解.

3 結(jié)論

通過對硫酸鋇光電比濁法測定皂角硫酸多糖中硫含量的各種影響因素進(jìn)行研究，得到相關(guān)的適宜測定條件.確定溶解氯化鋇的明膠濃度為0.75%，三氯乙酸濃度為3%，樣品溶液水解時(shí)間為3小時(shí)，溶解樣品的鹽酸濃度為1mol/L，每溶解1mg樣品鹽酸用量為5ml.對于該方法測定準(zhǔn)確性等內(nèi)容將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究.

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