李丹丹 李巖

土槿皮乙酸對肝癌 BEL-7402細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響

李丹丹 李巖

目的 研究土槿皮乙酸對人肝癌 BEL-7402細(xì)胞株轉(zhuǎn)移能力的影響。方法 體外培養(yǎng)人肝癌 BEL-7402細(xì)胞株,用不同濃度 PAB及只用培養(yǎng)基(對照組)作用不同時間后,應(yīng)用 MTT法篩選最佳藥物濃度。通過 Transwell檢測 PAB對細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果 土槿皮乙酸作用后肝癌細(xì)胞粘附率較對照組明顯下降(P＜0.05),并呈時間和濃度依賴性。土槿皮乙酸作用后遷移細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組。結(jié)論 土槿皮乙酸能抑制肝癌細(xì)胞增殖,降低肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力。

土槿皮乙酸;肝癌細(xì)胞;增殖;轉(zhuǎn)移

土槿皮乙酸(pseudorlaricacid-B,PAB)是從我國的松科植物金錢松的根皮及近根皮中分離出來的二萜類化合物,為一種單體成分。研究證明 PAB可以抑制胃癌[1,2]、肝癌[3]、宮頸癌[4]白血病[5]等多種腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,但尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān) PAB對肝癌侵襲轉(zhuǎn)移作用的報道,本實驗將探討 PAB對肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響,以為進(jìn)一步開發(fā)治療肝癌的新藥提供試驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株BEL-7402由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院傳染科實驗室惠贈,在含 10%胎牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)液、飽和濕度,飽和溫度為 37℃,CO2濃度為 5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 材料 RPMI1640培養(yǎng)基購自 Gibco公司、胎牛血清購自天津灝洋生物制品公司;噻唑藍(lán)(MTT)購自 Sigma公司;帶有 8μm微孔聚碳酸酯膜的 Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室購于美國 Costar公司。土槿皮乙酸標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品檢定所,批號:110880。

1.3 MTT比色法檢測細(xì)胞增殖 收集對數(shù)生長期的 BEL-7402細(xì)胞,接種于用 96孔培養(yǎng)板中,每孔 100μl。實驗組一組加 0.5μmol/L-1PAB分別培養(yǎng) 24、48、72h,另一組加入不同濃度的 PAB使其終濃度分別為 4、2、1、0.5μmol/L,培養(yǎng) 24 h。對照組加入 100μl含 10%胎牛血清的培養(yǎng)基,于上述培養(yǎng)時間后,加入濃度為 5g/L的 MTT20μl。繼續(xù)培養(yǎng) 4h后加 DMSO150μl,振蕩 10min后,用酶聯(lián)儀于 570nm處測出各孔吸光度值(OD),計算生長抑制率,實驗重復(fù) 3次。生長抑制率 =[1-(處理組平均 OD值/對照組平均 OD值)]×100%。

1.4 Transwell檢測 PAB對 BEL-7402細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響取指數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗,打勻的細(xì)胞懸液加入 Transwell小室,同時加入 0.5μmol/L-1PAB,我選擇的 PAB濃度是用 MTT篩選出的 72h的 IC50,以血清濃度差作為趨化條件:小室內(nèi)為含 1%血清的培養(yǎng)基,下室為含 30%血清的培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng) 24h后予甲醇固定,姬姆薩染色,取膜,封片,鏡檢。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,計量資料以均數(shù)(±s)表示,采用 t檢驗,P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PAB對 BEL-7402細(xì)胞增殖的影響 不同濃度 PAB(0.5,1.0,2.0,4.0)作用相同時間,隨著藥物濃度的增加,對細(xì)胞生長的抑制率增加,相同濃度 PAB作用不同時間(24,48,48h),隨著時間的增加,對細(xì)胞生長的抑制率增加。表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性和時間依賴性 0.5μmol/LPAB作用 24 h,對細(xì)胞生長無顯著影響。(表 1)

表 1 MTT法檢測 PAB對 Bel-7402細(xì)胞增殖的影響

2.2 PAB對 BEL-7402細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響 0.5μmol/LPAB組作用 24h后遷移細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組,對照組細(xì)胞輪廓清晰,活力旺盛,PAB組細(xì)胞明顯變圓,稀疏。提示PAB對于肝癌BEL-7402細(xì)胞的遷移能力有明顯的抑制作用(見圖 1)。

圖 1 Transwell檢測 PAB對 BEL-7402細(xì)胞遷移的影響

3 討論

土槿乙酸傳統(tǒng)上是作為一種抗真菌藥物,后來發(fā)現(xiàn)其具有抗生育、抗血管生成和抗腫瘤作用。研究證明 PAB可以抑制胃癌[1,2]、肺癌、肝癌[3]、宮頸癌[4]白血病[5]等多種腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,但尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)PAB對肝癌侵襲轉(zhuǎn)移作用的報道,本實驗研究發(fā)現(xiàn)土槿皮乙酸作用后肝癌細(xì)胞粘附率、轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)較對照組明顯下降(P＜0.05),并呈時間和濃度依賴性。土槿皮乙酸對肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響,其作用機(jī)制可能與清除氧自由基,作用于細(xì)胞周期集細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶,影響 p53、Bcl-2家族、Caspase激活[6],影響與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路等有關(guān)。

PAB具有明確的抑制血管生成作用,血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是最具有效性和特異性的誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生成的因子[7],是多種抗腫瘤藥物的作用靶點。2004年 TanWF等的研究顯示 PAB可以阻止 VEGF誘導(dǎo)的KDR磷酸化,但是并不影響 KDR的總蛋白水平。另外 PAB也降低了 Akt和ERK的磷酸化[8]。土槿皮乙酸有效劑量內(nèi)并未觀察到毒性反應(yīng),通過用BALB/C-nu祼鼠進(jìn)行活體肝腫瘤藥敏試驗顯示:PAB對腫廇的抑制呈劑量依賴性,25mg/(kg·d)的劑量可以被動物耐受,且沒有毒性表現(xiàn)和體質(zhì)量減輕現(xiàn)象[9]。

綜上所述,土槿皮乙酸對肝癌細(xì)胞增殖和凋亡[3]確實有影響,本實驗發(fā)現(xiàn)土槿皮乙酸對肝癌轉(zhuǎn)移能力有抑制作用,但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究,以為進(jìn)一步開發(fā)治療肝癌的新藥提供試驗依據(jù)。

[1] 徐永紅,王學(xué)清,鞠曉華,等.土槿皮乙酸誘導(dǎo)人胃癌 SGC7901細(xì)胞凋亡及機(jī)制,中國藥理學(xué)通報,2008,24(5):601-606.

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[3] 鞠曉華,徐永紅,李巖.土槿皮乙酸對 BEL-7402細(xì)胞凋亡、線粒體膜電位及 COX-2蛋白表達(dá)的影響.世界華人消化雜志,2008,4,16(11):1151-1156.

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[6] 龔顯峰,王敏偉,田代真一.土槿皮乙酸體外誘導(dǎo) A 375-S2細(xì)胞凋亡.中國中藥雜志,2005,30(1):55-57.

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110004中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院