冷佳蔚

巴洛沙星片微生物限度檢查方法驗證試驗研究

冷佳蔚

目的 建立巴洛沙星片微生物限度檢查法。方法 制備 1:10、1:100的供試液,采用離心沉淀與薄膜過濾的方法,來測定試驗菌的回收率。結(jié)果 供試品稀釋 100倍后,采用離心沉淀與薄膜過濾法,回收率即可達 70%以上。結(jié)論 可采用離心沉淀與薄膜過濾法消除巴洛沙星的抑菌活性,建立其微生物限度檢查法。

巴洛沙星;驗證試驗;離心沉淀;薄膜過濾

巴洛沙星是第三代喹諾酮類抗菌藥,具有廣譜的抗菌活性[2]。根據(jù)《中國藥典》2005年版二部規(guī)定所有非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料,在建立其微生物限度檢查法之前,應(yīng)進行細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法和控制菌檢查方法的驗證,以確認所采用的方法是否適合于該制劑的細菌、霉菌及酵母菌數(shù)的測定和控制菌檢查方法[1]。據(jù)此作者對巴洛沙星片的微生物限度檢查法進行了驗證試驗的研究,建立了巴洛沙星片的微生物限度檢查方法?，F(xiàn)報告如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 BSC-1500ⅡA 2-X生物潔凈安全柜;MJ-250I生化培養(yǎng)箱;GHP-9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱;SartoriusCP225D電子天平;HTY-2000B集菌儀(杭州泰林醫(yī)療器械廠生產(chǎn));NS01-75D 2薄膜過濾器(北京牛?；蚣夹g(shù)有限公司)。

1.2 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號:081215)、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號:080520)、營養(yǎng)肉湯(批號:070313)、改良馬丁培養(yǎng)基(批號:0810092)、膽鹽乳糖增菌液(批號:080117)稀釋液:PH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號:080921)均購于北京三藥科技開發(fā)公司。

1.3 藥物 巴洛沙星片(山東羅欣藥業(yè) 090230)規(guī)格:0.1g/片。

1.4 菌株 大腸埃希菌(Eschrichia coli)[CMCC(B)44 102];枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63 501];金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26 003];白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98 001];黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98 003]均購于中國生物制品檢定所醫(yī)學菌種保藏中心,以上菌種均為第 3代菌種。

2 驗證方法與結(jié)果

2.1 菌液制備[1]按《中國藥典》2005年版二部附錄“微生物限度檢查法”項下方法制成 50～100 CFU/m l的菌懸液。

2.2 供試液制備 取供試品 10 g,研磨加 PH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至 100ml,制成 1:10的供試液,再稀釋成 1:100的供試液。取 1:100的供試液以 500 r/min離心 3min取上清液,經(jīng)過濾后備用。

2.3 菌數(shù)計數(shù)方法的驗證

2.3.1 細菌數(shù)驗證方法的預試驗

2.3.1.1 試驗組 取上述制備好的 1:100供試液 1ml,按薄膜過濾法處理,用沖洗液分別沖洗濾膜 5次,100ml/次。在最后一次沖洗液中分別加入試驗菌 50～100 CFU/ml,取出濾膜分別貼于營養(yǎng)瓊脂平板上。將平板置 30℃～35℃培養(yǎng) 48 h,計數(shù)。

2.3.1.2 菌液組 測定加入的每一種試驗菌數(shù)。

2.3.1.3 供試品對照組 按試驗組的方法和條件測定供試品的本底數(shù)。

2.3.1.4 稀釋劑對照組 按試驗組的方法,加入 50～100 CFU/ml菌液,測定其菌數(shù)。

2.3.2 細菌數(shù)驗證方法的正式試驗 由預試驗結(jié)果表明,巴洛沙星對細菌具有較強的抑制作用,鑒于此作者把試驗方法調(diào)整為取 1:100的供試液 1m l,沖洗量增至 1000ml,重新進行驗證試驗。

2.3.3 霉菌和酵母菌數(shù)驗證方法

2.3.3.1 試驗組 取 1ml的 1:10供試液和 50～100 CFU/m l的菌液注入 1個平皿中,立刻傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基,每株菌制備 2個平皿。

2.3.3.2 菌液組 測定加入的每一種試驗菌數(shù)。

2.3.3.3 供試品對照組 按試驗組的方法測定供試品的本底數(shù)。

2.4 結(jié)果 回收率的計算公式:[(試驗組菌落計數(shù)(稀釋劑對照組菌落計數(shù))-供試品對照組菌落計數(shù))]÷菌液組菌落計數(shù) ×100%,最初采用 1:10稀釋度進行了摸索性試驗,結(jié)果三種試驗菌均受到抑制,尤其對枯草芽孢桿菌回收率為 0;故作者在預試驗中直接采用 1:100稀釋度,從表 1結(jié)果顯示,三種試驗菌的回收率也未達到 70%以上,說明巴洛沙星的抑菌作用很強。

表 1 1:100的供試液試驗菌回收率結(jié)果(500ml沖洗,n=3)

由表 2可見,通過正式試驗,試驗組和稀釋劑對照組的回收率均達到 70%以上,說明采用這一方法和沖洗條件,能有效地去除其抑菌活性,符合驗證試驗要求。通過表 3可見,采用平皿法就能使試驗組的回收率均達到 70%以上,說明巴洛沙星對真菌無抑制作用。

表 2 1:100的供試液試驗菌回收率結(jié)果(1000ml沖洗,n=3)

表 3 1:10供試液試驗菌回收率結(jié)果(n=3)

2.5 控制菌檢查方法的驗證

2.5.1 大腸埃希菌檢查方法的驗證

2.5.2 試驗組 取規(guī)定量 1:10的供試液以 500 r/m in離心3 m in后取全部上清液,將此液全部轉(zhuǎn)移至 500ml PH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中,搖勻,按薄膜過濾法處理,用沖洗液分別沖洗濾膜 10次,100ml/次。在最后一次沖洗液中加入10～100 CFU/ml大腸埃希菌,然后將 100ml的膽鹽乳糖增菌液培養(yǎng)基泵入濾器內(nèi),按相應(yīng)控制菌檢查法檢查。

2.5.3 陰性菌對照組 操作方法同試驗組。試驗菌改為金黃色葡萄球菌作為陰性菌對照菌。

2.5.4 驗證結(jié)果 試驗組檢出大腸埃希菌,陰性菌對照組未檢出金黃色葡萄球菌,說明上述方法可以用于巴洛沙星片的大腸埃希菌的檢查。

3 討論

巴洛沙星屬于喹諾酮類第三代抗生素,其對革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、厭氧菌、支原體、衣原體、軍團菌及某些分枝桿菌都具有較強抗菌活性,且具有良好的藥動學性質(zhì)[3]。這一點與驗證實驗結(jié)果(表 1)是一致的。因此,此類藥物建立微生物限度檢查法時,消除藥物的抑菌活性是關(guān)鍵技術(shù)。本實驗通過多次摸索,建立了巴洛沙星片的微生物限度檢查方法即:細菌數(shù)測定:取 1:100供試液 1ml,按薄膜過濾法,用 1000ml PH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液分 10次沖洗后貼膜。霉菌和酵母菌數(shù)測定:由表 3可知,采用平皿法試驗菌的回收率即可達到 70%以上?？刂凭鷻z查:采用離心沉淀法和薄膜過濾法聯(lián)合應(yīng)用,依法進行檢查?？傊?本論文建立了抑菌活性較強的巴洛沙星片微生物限度驗證實驗方法,為其他活性較強的抗菌藥物微生物限度驗證實驗提供了借鑒和思路。

[1] 中國藥典委員會.中國藥典.北京:化工工業(yè)出版社,2005(二部):附錄 89.

[2] 劉明亮.喹諾酮類抗菌藥在不同介質(zhì)中的理化性質(zhì).國外醫(yī)藥抗生素分冊,2006,27(1):22.

[3] 糜志遠,劉萬忠.新氟喹諾酮類抗生素巴洛沙星研究進展.中國新藥雜志,2005,14(9):28.

A method for validation ofmicrobial limit tests of balofloxacin tablets

LENG Jia-wei.The Drug Control INstitueof Shandong,Shandong250101,China

Objective To setup amethod for dermim ingmicrobial limits in balofloxacin tablets.Methods 1:10,1:100 sample test solutionwere prepared,and the centrifugation,membrane filtrationmethod were applied.The recovery was detected.Results When the sample dilution 100 times,the recovery was over 70%with themethod of centrifugation andmembrane filtration.Conclusion Aftermethod of centrifugation collection andmembrane filtration,the amount of bacteria and controled bacteria can be determined in balofloxacin tablets.

Balofloxacin;Validation;Centrifuqation;Membrance filtration

250101山東省藥品檢驗所