李現(xiàn)勝

（山東省臨朐縣畜牧局，臨朐 262600）

雞致病性大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)

李現(xiàn)勝

（山東省臨朐縣畜牧局，臨朐 262600）

本文介紹了山東濰坊市各雞場近1年來發(fā)生的雞大腸桿菌病所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)。試驗(yàn)通過收集臨朐畜牧局動物門診臨床診斷為大腸桿菌病的雞只病料作為被檢材料，對之進(jìn)行了分離培養(yǎng)、生化鑒定、動物試驗(yàn)及藥敏試驗(yàn)。結(jié)果表明，該菌對阿米卡星、氟苯尼考、頭孢哌哃、磷霉素鈉等藥物有較高的敏感性，而對鏈霉素、四環(huán)素、阿莫西林等藥物的敏感性較低。

雞 大腸桿菌 分離 鑒定 藥敏試驗(yàn)

雞大腸桿菌病是由致病性血清型的埃希氏大腸桿菌引起的一類傳染病的總稱。本病的感染途徑很多，主要通過消化道和呼吸道感染，也可通過種蛋垂直傳播等，臨床上可引起急性敗血癥、眼炎、心包炎、肝周炎、輸卵管炎、氣囊炎、關(guān)節(jié)炎等多種病型。近年來，隨著集約化養(yǎng)禽業(yè)的迅速發(fā)展，在一些養(yǎng)殖密集區(qū)廣泛流行，個別地方已呈爆發(fā)流行的趨勢，發(fā)病率有時(shí)可高達(dá)70%左右，死亡率在50%不等，該病已成為困擾養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的主要疾病之一。

本實(shí)驗(yàn)通過對細(xì)菌的分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、動物試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)等一系列細(xì)菌生物學(xué)試驗(yàn)，來分析研究本地區(qū)養(yǎng)雞場內(nèi)常發(fā)生的大腸桿菌病，并深入了解其發(fā)病機(jī)理、病原特性以及預(yù)防機(jī)制，以便獲得更好的臨床應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 所有病料均來自于臨朐縣畜牧局動物門診日常診斷病例，初步確診為大腸桿菌病的病雞68只，其中肉仔雞、蛋雛雞41只，育成雞27只。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑 麥康凱瓊脂（NA）、伊紅美蘭瓊脂、普通肉湯、營養(yǎng)瓊脂（NA）（均購自上海伯奧生物科技有限公）；硝酸鹽還原劑、氧化酶試劑、微量生化試驗(yàn)管、藥敏紙片購自（均購自杭州天和微生物試劑有限公司）。

1.1.3 試驗(yàn)動物 各日齡健康雞（購自山東濟(jì)南SPF種雞場）。

1.1.4 儀器及設(shè)備 光學(xué)顯微鏡、恒溫箱、高壓滅菌器、無菌實(shí)驗(yàn)臺、微量移液器等。

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌的分離培養(yǎng) 以無菌操作的方法，采取病死雞的肝、脾、心包液、氣囊膜等處病料，劃線于麥康凱瓊脂上，37 ℃培養(yǎng)24～48 h挑取紅色單個菌落劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，挑取紫黑色帶金屬光澤的單個菌落接種于普通肉湯和普通瓊脂斜面，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，用石蠟?zāi)z塞密封，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 形態(tài)學(xué)觀察 取伊紅美藍(lán)瓊脂平板上紫黑色帶金屬光澤的單個菌落涂片，革蘭氏染色鏡檢，觀察記錄菌體形態(tài)和染色特征。

1.2.3 生化鑒定 取微量生化管及各種生化培養(yǎng)基，將分離菌純培養(yǎng)物的菌種接入后封口，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，觀察結(jié)果。

1.2.4 致病性試驗(yàn) 將分離到的大腸桿菌接種普通肉湯培養(yǎng)物，37 ℃培養(yǎng)24 h。經(jīng)測定每毫升肉湯培養(yǎng)物約含1× 109CFU。按每株菌3只（5日齡健康非免疫雛雞），頸部皮下注射0.2 ml/只。對照組6只頸部皮下注射滅菌肉湯。及時(shí)剖檢死亡雞，分離細(xì)菌。判定標(biāo)準(zhǔn)：能使試驗(yàn)雞在24 h內(nèi)全部死亡或在48 h內(nèi)死亡2/3以上的菌株作為致病菌株。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 將獲得的致病菌株的菌液，均勻涂抹于營養(yǎng)瓊脂平板，每菌株2板，然后將藥敏紙片平均分布，37 ℃培養(yǎng)24 h。

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌的分離培養(yǎng)

麥康凱瓊脂上形成紅色、圓形隆起、光滑濕潤、邊緣整齊、直徑為1.5～2.5 mm的小菌落；在伊紅美藍(lán)瓊脂上形成紫黑色、具有金屬光澤的小菌落；在普通瓊脂斜面上的菌落為灰白色；在普通肉湯中呈均勻渾濁，管底有灰白色沉淀，并有糞臭味。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察

經(jīng)鏡檢可見到革蘭氏陰性，兩端鈍圓，長約1.5～3.0μm的短小桿菌，多單在，偶有2～3個菌體相連，無芽孢。

2.3 生化鑒定

將分離到的68個菌株，經(jīng)生化試驗(yàn)鑒定，符合大腸桿菌特征見表1。

表1 分離菌生化試驗(yàn)結(jié)果

2.4 致病性實(shí)驗(yàn)

大部分雛雞6 h以后開始出現(xiàn)癥狀，表現(xiàn)精神沉郁，食欲下降，多數(shù)出現(xiàn)腹瀉，有的出現(xiàn)神經(jīng)癥狀。接種12 h后開始出現(xiàn)死亡。剖檢死亡雞，表現(xiàn)為典型大腸桿菌病病變，并從死亡雞病變組織均回收到相應(yīng)接種致病菌株。在分離的68株菌中確認(rèn)56株為致病性菌株，占分離菌株的82.35%。

2.5 藥敏試驗(yàn)

其中阿米卡星、頭孢哌酮、氟苯尼考敏、磷霉素鈉敏感率達(dá)到85%以上，而四環(huán)素、鏈霉素、阿莫西林等藥物的敏感性較低。統(tǒng)計(jì)情況見表2。

表2 耐藥性實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

3 討論

3.1 關(guān)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從臨朐縣畜牧局動物門診日常疑似病例抽取的68只病雞中分離出68株菌株，涂片鏡檢、生化試驗(yàn)等方法分離鑒定，均符合大腸桿菌特征，確定全部為大腸桿菌。經(jīng)致病性動物試驗(yàn)，共56株菌為致病性大腸桿菌。說明本地區(qū)雞大腸桿菌的致病率與致死率都很高，需要本地區(qū)的養(yǎng)殖戶必須提高警惕與做好防范措施。

3.2 藥物防治

藥敏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本地區(qū)雞致病性大腸桿菌對阿米卡星、頭孢哌酮、氟苯尼考、磷霉素鈉有較高的敏感性，可考慮投入臨床使用；而四環(huán)素、鏈霉素、阿莫西林等藥物的敏感性較低，該區(qū)養(yǎng)殖戶應(yīng)慎用或不用。該區(qū)養(yǎng)殖戶還應(yīng)注意正確的用藥措施，長時(shí)間使用一種藥物易產(chǎn)生耐藥性，細(xì)菌耐藥性的發(fā)生和發(fā)展正是抗菌藥物廣泛應(yīng)用，特別是濫用藥物的結(jié)果。因此廣大養(yǎng)殖戶在治療大腸桿菌病時(shí)必須注意用藥問題，加強(qiáng)抗菌藥物的質(zhì)量監(jiān)督，合理選用藥物，在有限的條件下盡量避免耐藥菌株的產(chǎn)生。所以選擇藥物時(shí)必須先進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，應(yīng)盡量采取“交替”的用藥方案，可在發(fā)病日齡前1～2d進(jìn)行預(yù)防性投藥。近些年來，利用中草藥防治雞大腸桿菌病取得了明顯的效果。目前業(yè)內(nèi)已有報(bào)道，用清瘟敗毒散、復(fù)方黃連口服液、禽菌靈、大腸桿菌凈等藥物對大腸桿菌性腹瀉治愈率達(dá)80%以上。

3.3 疫苗免疫

由于大腸桿菌血清型多，不同血清型抗原性不同，因此市場上的疫苗具有一定的局限性。在常發(fā)病的養(yǎng)禽場，有條件的可從本場病禽中分離出致病性的大腸桿菌，制成自家多價(jià)滅活疫苗。建議在雛雞7～15日齡、25～35日齡、120～140日齡各免疫1次。