何選林， 王群英

(湖南省永州市藥品檢驗(yàn)所，湖南永州425100)

三七膠囊由三七細(xì)粉制成的膠囊，具有散瘀止血，消腫定痛，用于咯血、吐血、衄血、便血、崩漏、外傷出血、胸腹刺痛，跌撲腫痛，原發(fā)性血小板減少性紫癜［1］。三七皂苷 R1、人參皂苷 Rg1、Re、Rb1是三七的主要活性成分［2］。關(guān)于三七膠囊的含量測(cè)定只測(cè)定人參皂苷Rg1［3］。本試驗(yàn)采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定三七膠囊中三七皂苷R1及人參皂苷Rg1、Re、Rb1含量［4-8］，為該產(chǎn)品質(zhì)量控制提供方法依據(jù)和參考。

1 儀器與試藥

Waters高效液相色譜系統(tǒng)1525泵，2996紫外檢測(cè)器(美國(guó))，Empowers工作站。三七皂苷R1對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110745-200415)，人參皂苷Rg1對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110703-200726)，人參皂苷Re對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110754-200822)，人參皂苷Rb1對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110704-200921)，三七膠囊樣品(規(guī)格0.3 g/粒，A 公司生產(chǎn)批號(hào)為090301、090501、100201、3 批產(chǎn)品);乙腈為色譜純、重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Ultimate XB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-水為流動(dòng)相，按表 1 進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm;柱溫:室溫，進(jìn)樣量:10 μL［9-11］。

在該色譜條件下，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1的保留時(shí)間分別為 32.8 min、36.5 min、37.2 min、61.5 min，理論塔板數(shù)分別為 1.2 ×105、1.2×105、1.5 ×105、5.0 ×105，人參皂苷 Rg1與 Re分離度為1.9，見圖1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution

2.2 對(duì)照品溶液貯備液和對(duì)照品溶液的制備 精密稱取三七皂苷R1;人參皂苷Rg1、Re、Rb1對(duì)照品分別為 5.32 mg、20.10 mg、5.42 mg、20.11 mg 置25 mL量瓶中，用甲醇適量振搖使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品貯備液。再精密吸取貯備液5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品0.6 g，置50 mL量瓶中，加甲醇40 mL，超聲30 min，放冷后，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 取溶劑作為陰性對(duì)照溶液。

2.5 線性關(guān)系考察 精密量取混合對(duì)照品貯備液1，2，3，5，10 mL 溶液分別置 10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，求回歸方程，三七皂苷R1、人參皂苷 Rg1、Re、Rb1的回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為:Y=165.8+259 122.1X，r=0.999 96;Y=1 804.7+1 441 035.6X，r=0.999 92;Y=147.1+218 035.3X，r=0.999 90;Y=685.16+842 120.8X，r=0.999 96，結(jié)果表明，當(dāng)進(jìn)樣量為10 μL時(shí)，三七皂苷 R1、人參皂苷 Re在 20～200 μg/mL，人參皂苷 Rg1、Rb1在80 ～800 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度考察 取2.2項(xiàng)下的溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄連續(xù)5次的峰面積，三七皂苷R1:RSD=0.60%;人參皂苷Rg1:RSD=0.35%;人參皂苷 Re:RSD=0.95%;人參皂苷 Rb1:RSD=0.77%。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取2.11項(xiàng)下同一份樣品測(cè)定5次，含三七皂苷R1為0.81%(RSD=1.06%);人參皂苷Rg1為3.27%(RSD=1.18%);人參皂苷 Re為1.07%(RSD=1.48%);人參皂苷Rb1為3.10%(RSD=0.80%);結(jié)果表明重復(fù)性好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同份樣品分別在0、4、8、12、16 h測(cè)定三七皂苷R1及人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量，含三七皂苷R1為0.80%(RSD=1.10%);人參皂苷Rg1為3.29%(RSD=1.15%);人參皂苷Re為1.06%(RSD=1.38%);人參皂苷Rb1為3.15%(RSD=0.84%);結(jié)果表明穩(wěn)定性好。

2.9 陰性對(duì)照試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液按本文條件進(jìn)樣為10 μL，色譜圖見圖1，在本文條件下陰性對(duì)照無(wú)干擾。

圖1 高效液相色譜Fig.1 HPLC chromatograms

2.10 回收率試驗(yàn) 精密取已知含量的同一批樣品6份，分別精密加入三七皂苷R1及人參皂苷Rg1、Re、Rb1對(duì)照品適量，按樣品測(cè)定項(xiàng)下制備供回收用的溶液，依法測(cè)定即得回收率，結(jié)果見表2。

2.11 含量測(cè)定 分別吸取2.3項(xiàng)下供試品溶液與2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液各10 μL，照2.1項(xiàng)的色譜條件，記錄色譜圖見A、B，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，含量結(jié)果見表3。

表2 加樣回收率測(cè)定結(jié)果Tab.2 Results of recovery test

表3 樣品的含量測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.3 Result of sample determination(n=3)

3 討論

3.1 三七膠囊由三七純中藥制成，但三七成分復(fù)雜未知，本實(shí)驗(yàn)選取的梯度系統(tǒng)，能夠滿足系統(tǒng)適應(yīng)性并保證各成分分離的重現(xiàn)性，可對(duì)三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1同時(shí)準(zhǔn)確定量，能有效地監(jiān)控三七膠囊的內(nèi)在質(zhì)量。

3.2 在處理樣品時(shí)，曾參考《中國(guó)藥典》三七的含量測(cè)定的處理方法，但從實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三七中4種成分的含量偏低，本試驗(yàn)樣品直接用甲醇超聲處理，樣品中4種指標(biāo)成分HPLC達(dá)到基線分離。

［1］新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)第22冊(cè)［S］.2002:646.

［2］王 雁，畢開順.三七HPLC指紋圖譜的建立［J］.中國(guó)中藥雜志，2003，28(4):316-320.

［3］國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編內(nèi)科氣血津液分冊(cè)［S］.2002:19.

［4］中國(guó)藥典［S］.一部.2010:11.

［5］馮 中，李曉燕，劉 波，等.HPLC測(cè)定不同廠家復(fù)方丹參片中三七皂苷R1和人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量［J］.中成藥，2009，31(1):71-74.

［6］柯金虎，孫玉琴，馬 妮，等.HPLC法測(cè)定三七保肝膠囊中皂苷的含量［J］.中國(guó)科技雜志，2004，(3):40-42.

［7］粟曉黎，王寶琹.三七及復(fù)方丹參片含量測(cè)定方法的研究［J］.中成藥，1990，12(3):10.

［8］邸 峰，孫毅坤，管慶霞，等.高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方丹參片中三七皂甙R1的含量［J］.中國(guó)中藥雜志，1996，21(11):672.

［9］何夏秋，楊 蕾，賀建華，等.用HPLC法測(cè)定三七及益尿通膠囊中人參皂苷Rg1的含量［J］.中國(guó)中藥雜志，2001，26(1):37.

［10］王 強(qiáng)，江英橋，馬世平，等.高效液相色譜法測(cè)定三七中三七皂苷 R1的含量［J］.中國(guó)中藥雜志，2000，25(10):617.

［11］權(quán)麗輝，趙淑平，薛 嵐，等.HPLC測(cè)定鑫森腦泰粉針劑中三七皂苷 R1的含量［J］.中草藥，2001，32(6):502.