李喬麗 戴建輝 高云濤*

（1 云南民族大學(xué)化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500；

2 民族藥資源化學(xué)國家民委—教育部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500）

葉下珠[1,2]（Phyllanthus urinaria L.），又名珍珠草，為大戟科袖柑屬植物全草，是云南各民族經(jīng)常藥用或食用的植物，是一種重要的傣族藥，在傣族醫(yī)學(xué)中，葉下珠稱為“雅巴?！保饕糜谇鍩峤舛镜?。研究發(fā)現(xiàn)，葉下珠具有平肝清熱、抗乙肝病毒和保肝作用[3]，以及利水解毒和明目等功效，主要活性成分為植物多酚，如沒食子酸，短葉蘇木酚酸和揉云實(shí)精等[4]，是一種具有較高藥用價(jià)值的民族藥材，值得進(jìn)一步的研究。

本文研究了葉下珠乙醇提取物對(duì)超氧陰離子自由基清除活性、抑制脂質(zhì)過氧化活性和紅細(xì)胞的氧化損傷活性，為深入研究葉下珠的生物活性及開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器

葉下珠樣品（全株，干制，購自西雙版納傣醫(yī)院），使用前粉碎至80目。

無水乙醇，硫酸亞鐵，EDTA-Fe（Ⅱ）溶液：2.5mmol/L，0.1mol/L pH 7.4 PBS緩沖液，核黃素溶液：1.67×10-5mol/L，蛋氨酸溶液：0.01mol/L蛋氨酸，氯化硝基四氮唑蘭（NBT）溶液：4.6×10-5mol/L，上述3種溶液均用pH=7.4的PBS緩沖液配制；卵磷脂溶液：6.7mg/mL，200mg卵磷脂冰浴震蕩溶解于30mL 0.01mol/L pH 7.4 PBS緩沖液；鄰苯三酚；2-硫代巴比妥酸（TBA）溶液：1%（W/V）；三氯乙酸（TCA）溶液：28%（W/V），臨用前配制。

光照箱（自制，35cm×30cm×25cm，光源為純稀土節(jié)能燈，燈功率45w），容積330×270×290cm，體積10.0L，頻率40/60KHz，實(shí)驗(yàn)使用超聲頻率為60kHz，輸出功率320W。萃取容器置于超聲清洗器中部，RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），7200型可見分光光度計(jì)（尤尼柯上海儀器有限公司）。

所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 提取物溶液的制備

取葉下珠樣品100.0g，首先乙醚除去葉綠素和脂類，用500mL乙醚浸泡8h，超聲提取20min，過濾，棄去濾液，濾渣風(fēng)干后用70%乙醇按料液比1∶5浸泡8h，超聲提取30min，重復(fù)提取3次，合并3次濾液，減壓蒸除溶劑后得乙醇提取物浸膏。浸膏得率為原材料的11.2%，用25%乙醇配制不同濃度的取葉下珠提取物溶液供試驗(yàn)使用。

1.2.2 清除超氧陰離子自由基活性實(shí)驗(yàn)

超氧陰離子自由基采用光照核黃素方法[5]，取1.67×10- 5mol/L核黃素、0.01mol/L蛋氨酸，4.6×10-5mol/L氯化硝基四氮唑蘭（NBT）溶液各2.0mL，混勻，加入不同濃度的葉下珠提取物溶液1.0mL，置于光照箱中光照反應(yīng)30min，測定560 nm處吸光度（A樣），同時(shí)測定緩沖溶液空白吸光度（A0），計(jì)算清除超氧陰離子自由基清除率：

1.2.3 抗脂質(zhì)過氧化作用

采用文獻(xiàn)[6]的方法，以卵磷脂脂質(zhì)體模擬細(xì)胞雙層磷脂膜，該方法利用Fenton反應(yīng)生羥自由基，羥自由基進(jìn)攻卵磷脂誘導(dǎo)丙二醛（MDA）類似物的產(chǎn)生，MDA與體系中的硫代巴比妥酸（TBA）反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)，可用分光光度法測定MDA的量評(píng)估氧化，加入葉下珠提取物后，對(duì)MDA的生成有抑制作用，據(jù)此可評(píng)價(jià)葉下珠提取物對(duì)脂質(zhì)過氧化的抑制活性。取1.0mL 3.4mg/mL卵磷脂液，加入PBS緩沖液（pH 7.4）1.0mL，不同濃度的葉下珠提取物溶液1.0 mL，混勻，隨后加入2.5mmol/L EDTA-Fe（Ⅱ） 1.0mL，置于37℃水浴中，加熱45min后加入28%（W/V）的TCA 2.0mL，1%（W/V）的TBA 1.0mL，于沸水浴中加熱反應(yīng)10min，取出迅速冷卻，測定532nm處吸光度（A樣），以PBS緩沖液為空白（A0）。按下式計(jì)算抑制率：

1.2.4 對(duì)紅細(xì)胞的氧化損傷抑制作用

以文獻(xiàn)報(bào)道的鄰苯三酚-紅細(xì)胞體系[7]為模型，利用鄰苯三酚在堿性條件下自氧化放出超氧自由基 ，使紅細(xì)胞膜中的類脂分子的不飽和鍵發(fā)生氧化，氧化損傷產(chǎn)物在λ=439nm處產(chǎn)生最大吸收，加入葉下珠提取物溶液后抑制氧化反應(yīng)，導(dǎo)致吸光度A439nm降低，以此評(píng)價(jià)抑制作用。紅細(xì)胞取自正常人靜脈血，用等滲磷酸緩沖液配成10mL/L紅細(xì)胞懸浮液。取1.0mL紅細(xì)胞懸浮液，加入5.0mL 0.1mol/L pH 7.4 PBS緩沖液，加入不同濃度的葉下珠提取物溶液0.10mL，放置10min，使萃取物與紅細(xì)胞懸浮液充分作用，加入0.10mL鄰苯三酚溶液（50mmol/L）啟動(dòng)自由基氧化反應(yīng)，反應(yīng)10min后測定439nm處吸光度（A樣品），同時(shí)測定空白樣吸光度（A損傷）。

2 結(jié)果與討論

2.1 對(duì)超氧自由的清除作用

對(duì)超氧自由的清除作用可以用清除率為50%時(shí)的萃取物濃度IC50和最大清除率ICmax表達(dá)，IC50越小、ICmax越大，表明萃取物對(duì)自由基的清除作用越強(qiáng)，研究選擇抗氧化化活性較高的茶多酚為對(duì)照。葉下珠提取物對(duì)光照核黃素超氧自由基的清除作用見圖1，從圖可知，葉下珠提取物對(duì)超氧自由基具有較好的清除作用，并呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系，IC50值為0.0817mg/mL，茶多酚IC50值為0.0503mg/mL，說明葉下珠提取物抗氧化活性啟動(dòng)濃度高于茶多酚，但葉下珠提取物最大清除率ICmax（69.1%）卻高于茶多酚（65.4%）。

圖1 葉下珠提取物對(duì)超氧自由基的清除作用

2.2 對(duì)脂質(zhì)過氧化抑制作用

對(duì)脂質(zhì)過氧化抑制作用強(qiáng)弱可用抑制率同樣可用50%時(shí)的濃度IC50和最大抑制率ICmax表示，并以茶多酚為對(duì)照，結(jié)果見圖2。

從圖2可知，葉下珠提取物對(duì)脂質(zhì)過氧化具有較好的抑制作用，隨著葉下珠提取物濃度增加，脂質(zhì)過氧化抑制率也隨之增加，但葉下珠提取物濃度增加到時(shí)抑制率達(dá)到最大，從圖可知，葉下珠提取物的抑制作用略高于茶多酚，葉下珠提取物和茶多酚的IC50值分別為0.092mg/mL、0.1mg/mL，ICmax（69.1%）卻高于茶多酚（65.4%），ICma值分別為65.8%，64.2%。

圖2 葉下珠提取物對(duì)脂質(zhì)過氧化的抑制作用

2.3 對(duì)紅細(xì)胞的氧化損傷抑制作用

圖3為鄰苯三酚超氧自由基與紅細(xì)胞作用的吸收光譜，體系1為紅細(xì)胞（RBC）中加入鄰苯三酚超氧自由基，吸光體系2、3、4、5、6分別為紅細(xì)胞+鄰苯三酚體系加入0.02、0.05、0.10、0.15、0.20mg/mL葉下珠提取物，體系7為紅細(xì)胞懸浮液，從圖可知紅細(xì)胞懸浮液在整個(gè)測定波長范圍內(nèi)基本無吸收，加入鄰苯三酚超氧自由基后，在439nm處出現(xiàn)一個(gè)明顯的吸收峰，表明超氧自由基對(duì)紅細(xì)胞產(chǎn)生明顯損傷，加入葉下珠提取物后，439nm處吸收峰隨著提取物濃度增加而逐漸下降，表明葉下珠提取物對(duì)紅細(xì)胞的氧化損傷具有良好的抑制作用，且呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。

圖3 對(duì)超氧自由基誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化損傷抑制作用

3 結(jié) 論

本文研究表明葉下珠提取物具有良好的清除活性氧自由基作用，并能有效抑制MDA的生成和紅細(xì)胞氧化損傷，說明葉下珠可藥效作用可能與其良好的抗氧化活性作用密切相關(guān)，本文的研究結(jié)果為葉下珠的藥理活性研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì)編.中華本草[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2000：5076.

[2] 何廣新,周進(jìn)軍.珍珠草的生藥學(xué)研究[J].中國民族民間醫(yī)藥雜志,1998(3)：36-37.

[3] 任進(jìn)余,秦存林.苦味葉下珠、葉下珠的藥理作用及其作用機(jī)理[J].國外醫(yī)學(xué)·中醫(yī)中藥分冊(cè),1999,12(2)：3-6.

[4] 周宇,袁福華,楊連輝,等.葉下珠化學(xué)成分的研究進(jìn)展[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志,2007,25(4)：206-209.

[5] 劉杰超,王思新,焦中高,等.蘋果多酚提取物抗氧化活性的體外試驗(yàn)[J].果樹學(xué)報(bào),2005,22(2)：106-110.

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