黃秋月，劉文強 ，李志軍

（1.齊魯動物保健品有限公司，山東濟南 250100；2.聊城大學農(nóng)學院，山東聊城252059；3.浙江省桐鄉(xiāng)市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，浙江桐鄉(xiāng) 314500）

臨床上雞大腸桿菌分離株耐藥譜和毒力的關(guān)系

黃秋月1，劉文強2，李志軍3

（1.齊魯動物保健品有限公司，山東濟南 250100；2.聊城大學農(nóng)學院，山東聊城252059；3.浙江省桐鄉(xiāng)市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，浙江桐鄉(xiāng) 314500）

大腸桿菌病是各種動物由大腸桿菌屬細菌引起疾病的總稱。大腸桿菌的菌體抗原（O），表面抗原（K）和鞭毛抗原（F）構(gòu)成不同的血清型。大腸桿菌屬的某些血清型對人和動物有致病性，具有十分重要的公共衛(wèi)生學意義。該病可以引起雞的腹膜炎、輸卵管炎、臍炎、滑膜炎、氣囊炎、肉芽腫、眼炎等多種疾病，對養(yǎng)雞業(yè)危害較大。在肉用仔雞生產(chǎn)過程中更是常見多發(fā)病之一。而且其耐藥性的產(chǎn)生也越來越快，耐藥譜越來越廣。我們在發(fā)生本病的雞場內(nèi)分離到一株耐藥性異常嚴重的雞大腸桿菌，為了證實這種細菌耐藥性的嚴重性是否與細菌在動物機體內(nèi)增殖能力或者其毒力的增強有關(guān)，進行了以下實驗。

一、材料與方法

（一）參考菌株 雞大腸桿菌標準株(簡稱C株)和抑菌圈參考細菌（大腸桿菌，CVCC1570） 均購買自中國獸醫(yī)菌種保存數(shù)據(jù)庫。一般耐藥性的大腸桿菌分離株由山東農(nóng)業(yè)大學動物傳染病實驗室分離、鑒定并保存（簡稱B株，2002年）。

（二）培養(yǎng)基 包括用于初次分離的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，以及麥康凱瓊脂、普通瓊脂、三糖鐵（TSI）瓊脂、5%綿羊鮮血瓊脂、半固體糖發(fā)酵培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基等；微量生化鑒定管，購自杭州天和生物制品公司。

（三）藥敏紙片（36種） 購自杭州天和生物制品公司，批號：20050806。

（四）大腸桿菌屬診斷抗原和血清 哈爾濱獸醫(yī)研究所生產(chǎn)。

（五）試驗動物 1日齡蛋雛雞，購自風祥第一孵化廠。

（六）雞大腸桿菌田間分離株的鑒定

1.來源。該菌株寄主來自于山東某商品肉雞場，25日齡，為臨床上典型的大腸桿菌發(fā)病雞。大部分雞發(fā)病死亡，少數(shù)耐過雞生長停滯，此前用過大量抗生素治療均無效。剖檢后進行細菌分離：無菌采取病料于瓊脂平板上劃線分離，37℃有氧條件下培養(yǎng)24 h，然后挑取單個菌落經(jīng)下面步驟的鑒定，證實為純培養(yǎng)物，將其接種于鮮血瓊脂斜面上進行培養(yǎng)，得到純培養(yǎng)菌。

2.細菌鑒定。

(1) 形態(tài)結(jié)構(gòu)與染色特性：按常規(guī)方法對分離到的細菌進行形態(tài)結(jié)構(gòu)與染色特性觀察。

(2) 培養(yǎng)特性：分離菌的純培養(yǎng)物接種于普通瓊脂平板、伊紅-美蘭瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、三糖鐵瓊脂斜面、營養(yǎng)肉場等培養(yǎng)基中，37℃有氧條件下培養(yǎng)觀察其生長表現(xiàn)。同時另一組置于厭氧罐中37℃條件下培養(yǎng)觀察其生長表現(xiàn)。

(3) 生化試驗：用分離菌的純培養(yǎng)物進行糖發(fā)酵試驗、靛基質(zhì)試驗、吲哚試驗、甲基紅試驗、枸櫞酸鹽利用試驗以及其它生化反應(yīng)。

(4) 血清型鑒定：按玻片凝集法進行。

（七）藥物敏感實驗 將上述分離鑒定的田間分離株（簡稱A株）進行藥敏紙片擴散實驗，使用自動菌落計數(shù)器測量抑菌圈的直徑。結(jié)果判定，按照抑菌圈直徑大于25 mm為高度敏感，16～25 mm為中度敏感，小于16 mm為不敏感。同時對B株和C株進行藥敏實驗。

（八）大腸桿菌動物感染實驗 1日齡雛雞200只，其中180只隨機分為18組，第1～6組分別以點眼，滴鼻，口腔、皮下、肌肉和翼靜脈接種培養(yǎng)18 h的大腸桿菌（A株）肉湯培養(yǎng)液0.2 ml；第7～12組和第13～18組以同樣方式分別接種B株和C株培養(yǎng)液。分別隔離飼養(yǎng)， 其余20只接種生理鹽水作為對照。每6 h觀察發(fā)病和死亡情況，并記錄到24 h。對各組間的差異顯著性采取t檢驗。

二、結(jié)果與分析

（一）細菌培養(yǎng)特性 分離菌為兼性厭氧菌，該菌在麥康凱瓊脂上生長出紅色菌落；在伊紅-美蘭瓊脂上生成黑色帶金屬閃光的菌落；在普通瓊脂上生長出面光滑，邊緣整齊，灰白色半透明的單個小菌落；在5%綿羊鮮血瓊脂上生長出不溶血的灰白色、光滑、凸起、邊緣整齊的中等大小菌落；在營養(yǎng)肉湯中不形成菌膜和菌環(huán)，37℃、18 h后培養(yǎng)液表現(xiàn)為均勻渾濁。

（二）雞大腸桿菌的鑒定

1.形態(tài)。待檢菌為革蘭氏陰性、兩端鈍圓的小直桿菌。

2.生化特性。待檢菌的生化特性鑒定結(jié)果如下：發(fā)酵葡萄糖、乳糖、鼠李糖、麥芽糖、甘露醇；不發(fā)酵尿素酶，蔗糖、棉籽糖、側(cè)金盞花醇；靛基質(zhì)試驗（-）；吲哚試驗(+)；甲基紅試驗（+）；枸櫞酸鹽利用試驗（-）；三糖鐵上表現(xiàn)(-)。符合大腸桿菌的生化特征。

3.血清型鑒定。待檢菌經(jīng)大腸桿菌多價因子血清鑒定，其O抗原為O 1。

（三）待檢菌的藥敏試驗結(jié)果本試驗得到的大腸桿菌田間分離株A對以下藥物完全耐藥，得到的抑菌圈均為0。這些藥物包括青霉素、氨芐西林、阿莫西林、四環(huán)素、土霉素、多西環(huán)素、鏈霉素、慶大霉素、新霉素、阿米卡星、卡那霉素、壯觀霉素、紅霉素、乙酰螺旋霉素、新霉素、強力霉素、氯霉素、氟苯尼考、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢他定、頭孢呋辛、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、二氟沙星、沙拉沙星、氟哌酸、恩諾沙星、復(fù)方新諾明、磺胺嘧啶、桿菌肽、泰樂菌素、呋喃唑酮和萬古霉素。只有新生霉素有大約16 mm的抑菌圈。對以上36種抗生素的耐藥率為97.2%(35/36)。而大腸桿菌B株和C株的耐藥率分別為69.4%（25/36）和30.6%（11/36）。說明與標準株相比，田間分離株產(chǎn)生了明顯并且嚴重的耐藥性。

（四）動物攻毒實驗 24 h內(nèi)三組的死亡率見表1所示。其中，對照組C株攻擊后24 h內(nèi)死亡率為33.3%（20/60），A株和B株的死亡率分別為51.66%（31/60）和43.3%（26/60）。用EXCEL的t檢驗統(tǒng)計分析表明A組、B組和C組的差異均非常顯著，P<0.01。所有死亡雛雞體內(nèi)又重新分離到典型的雞大腸桿菌。

三、討論

我們在臨床發(fā)生嚴重大腸桿菌污染的雞場內(nèi)分離到一株大腸桿菌，經(jīng)形態(tài)學分析，染色特性分析，生化試驗鑒定和血清型鑒定發(fā)現(xiàn)，這是一株雞大腸桿菌O1型。藥敏試驗結(jié)果表明這是一株嚴重耐藥的大腸桿菌田間分離株，除了對新生霉素有中度敏感性外，對其余35種常見抗生素都產(chǎn)生了嚴重的耐藥性。而此前2002年分離到的大腸桿菌只有69.4%的耐藥率，大腸桿菌對照株則只有30.6%的耐藥率。

雞大腸桿菌主要通過水平傳播，并且對雛禽致死率高。為了模擬臨床實際的感染情況，我們沒有使用SPF雞，而是采用了普通的健康雞作為實驗動物。本文驗證了大腸桿菌在水平傳播中，不同的接種方式對該細菌的影響較大，皮下、肌肉和靜脈接種后細菌的增殖較快，在24 h內(nèi)就可造成雛雞發(fā)病，并造成較高的死亡率?？谇唤臃N的死亡率也較高，而三個菌株通過點眼和滴鼻均未造成雛雞的死亡，雞體內(nèi)（肝臟）也未分離到細菌。這一點可能與臨床實際發(fā)病情況比較一致。

本文的攻毒試驗似乎暗示耐藥性高的菌株，對于易感動物具有較高的致病力，至少該菌株在動物體內(nèi)增殖較快。而且，不管采取何種接種途徑，試驗結(jié)果都是一樣的。大腸桿菌對人和動物的致病力，與一些毒力因子有關(guān)，已知的有定植因子（菌毛）、內(nèi)毒素、外毒素、大腸桿菌素以及細胞毒素等。已經(jīng)知道，定植因子可增強細菌對寄主腸黏膜上皮細胞的粘附與侵襲作用，提高細菌在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中存活和增殖的能力，并且與細菌的毒力呈正相關(guān)。估計出現(xiàn)耐藥性和毒力同步升高的原因可能是耐藥性質(zhì)粒傳播耐藥性基因的頻率高于普通細菌，與此同時，定植因子傳播的頻率也高于普通細菌。二者是同時發(fā)生還是互為因果關(guān)系尚不可知。