羅 玉

(昆明學院生物科學與技術系，云南昆明650214)

海藻糖(а－D吡喃葡萄糖，а－D－吡喃型葡萄糖苷)是由兩個葡萄糖分子組成的雙糖，海藻糖是昆蟲中的血糖，是真菌中的貯藏碳水化合物，在細菌、酵母和動物中普遍存在。海藻糖結構缺乏誘導端，使海藻糖對熱、PH等不敏感。海藻糖對酸、堿、高溫的穩(wěn)定性強，吸水性強，使它在生物體內具有很強的抗脫水作用［1］，在干旱、寒冷、高鹽堿等逆境條件下可保護生物膜、蛋白質等免受傷害［2－3］。海藻糖在作物抗逆育種中有廣闊的應用前景。海藻糖是一種結構穩(wěn)定的非還原性雙糖，自身不與氨基酸或蛋白質等發(fā)生作用，具有明顯的化學惰性和極強的穩(wěn)定性。海藻糖常被用作穩(wěn)定劑、防腐保鮮劑，成為食品、化妝品、藥品中的添加劑。近年來，在高等植物中也發(fā)現(xiàn)了海藻糖的存在，植物中的海藻糖還參與代謝調控和基因表達調控，影響著植物生長、發(fā)育及對外界環(huán)境變化的反應［4－6］。海藻糖是一種典型的應激代謝與保護物質:當生物體生長環(huán)境良好時，體內不積累海藻糖;而當生物體處于脅迫環(huán)境時，體內就會迅速積累海藻糖［7－8］。海藻糖合成、分解及其調控中蘊含著生物生長發(fā)育、生物抗逆、生物對極端環(huán)境適應的重要機制，海藻糖作為一種新發(fā)現(xiàn)的信號分子［9］，弄清它的感知傳導途徑，與已知的糖信號之間的交叉反應，將極大的推進海藻糖在各領域中的應用。

1 海藻糖的代謝

海藻糖和蔗糖都是雙糖，它們在代謝上也很相似，見圖1。

圖1 兩種雙糖代謝途徑圖

UDPG和6－磷酸葡萄糖在TPS的作用下生成6－磷酸海藻糖，6－磷酸海藻糖在TPP作用下生成海藻糖。在大腸桿菌中，TPS和TPP分別由OtsA和OtsB基因編碼。在酵母菌中，海藻糖合成復合物包含三個亞單位，分別由TPS1，TPS2，TSL1基因編碼。其中TPS2編碼TPP蛋白，TSL1是編碼一個調節(jié)亞基。TSL1有一個同源基因TPS3［10］，TPS1基因編碼的蛋白具有完整的6－磷酸海藻糖合成酶活性。三個蛋白基因都含有GAAN/YTTC和C4T熱休克元件，熱誘導能提高酶活性。海藻糖的分解有多個途徑，在酵母中被海藻糖磷酸化酶分解為葡萄糖和1磷酸葡萄糖［11］。在大腸肝菌中，海藻糖被磷酸化之后，又被6－磷酸海藻糖水解酶水解成葡萄糖與6－磷酸葡萄糖［12］。在生物界中，無論植物、真菌、動物還是細菌中多由海藻糖酶分解為葡萄糖［13－14］。

TPS1除直接參與海藻糖合成外，還參與對糖酵解途徑的調節(jié)。原因之一是TPS1的產物6－磷酸海藻糖具有抑制己糖激酶的作用［10］。這一結果暗示在生物體遭遇環(huán)境脅迫而啟動海藻糖途徑后，葡萄糖進入糖酵解的途徑也可被有效限制。TPS1基因編碼的蛋白還起穩(wěn)定海藻糖合酶復合體的作用。TPS1基因的缺失也使6－磷酸海藻糖磷酸酯酶活性大大降低，并導致海藻糖合酶復合體解體。TPS2基因編碼的蛋白具有6－磷酸海藻糖磷酸酯酶活性，6－磷酸海藻糖磷酸酯酶的功能是催化6－磷酸海藻糖脫磷酸化形成海藻糖。植物中的與酵母TPS1和大腸肝菌OtSA同源的所有基因，都有一個約400氨基酸的C端結構域。植物中的這個結構域與酵母TPS2基因和大腸肝菌的OtSB基因有相當大的同源性?？赡艹薔端的合成酶活性外，在C端還有磷酸酶活性區(qū)域［15］。這有些類似于酵母中的TPS2基因，TPS2相當于一個雙功能蛋白質基因，雖然帶有一個N端TPS區(qū)域，但它不能像TPS1那樣有合成6－磷酸海藻糖的作用，而是編碼合成TPP［10］。

TPS是個多基因家族，到2001年已克隆的擬南芥TPS基因家族成員有11個［16］。從擬南芥中克隆到了酵母 TPS1、TPS2同源的基因，它們能彌補TPS1和 TPS2的不足［17］。從擬南芥中得到三個基因:AtTPSA、AtTPSD、AtTPSC，它們編碼的蛋白質與TPS和TPP有很大程度的同源性。在缺少TPS活性的tps1突變體中表達AtTPSA和AtTPSC時，在供給葡萄糖或熱沖擊之后也不能補充海藻糖的形成。此外，AtTPSA和AtTPSC在缺乏TPP活性的釀酒酵母tps2突變體中也不能補充TPP的作用。因此，得出與TPS/TPP同源的擬南芥基因編碼的蛋白質，在海藻糖合成中缺乏催化活性［18］。來源于鱗葉卷柏的編碼TPS的cDNA，使得釀酒酵母的tps1突變體恢復生長［19］。

海藻糖的合成與分解不僅存在于低等生物中，在高等植物中也存在。使用了海藻糖酶的抑制劑——有效酶素A，發(fā)現(xiàn)轉基因植物和野生型植物中海藻糖的積累增加［20］，這說明，高等植物中存在有內源的海藻糖代謝途徑。高等植物中不僅有海藻糖代謝存在，也有海藻糖酶存在，海藻糖酶的發(fā)現(xiàn)還先于植物中海藻糖代謝。早在1969年，從幼嫩甘蔗中發(fā)現(xiàn)了海藻糖酶。類似相繼的報道，說明海藻糖酶在許多高等植物中存在。已從馬鈴薯和大豆中克隆到了海藻糖酶cDNA［21］。海藻糖酶在植物中很常見，海藻糖酶能被有效霉素A高效抑制其活性。內源海藻糖在高等植物中合成量很少，野生型植株在有海藻糖酶抑制劑有效酶素A存在下，只積累少量的海藻糖，少于植株鮮重的0.01%［20］。

2 海藻糖與植物糖代謝和糖調控

蔗糖和海藻糖不僅代謝途徑類似，它們都有信號分子作用。海藻糖能代替蔗糖，調控碳水化合物的代謝。但海藻糖在高等植物中不像蔗糖那樣常見，海藻糖發(fā)現(xiàn)較晚，海藻糖的進化起源可能更早。

2.1 海藻糖影響植物光合作用，影響植物生長。

植物通過光合作用合成糖分，糖分是植物的碳源和能源物質，海藻糖能影響碳代謝，影響植物生長。高濃度的海藻糖可以抑制植物正常的生長和發(fā)育。在培養(yǎng)基中添加外源的海藻糖，能明顯抑制擬南芥幼苗根尖的伸長，外源的海藻糖強烈誘導淀粉合成基因APL3的表達，導致子葉中淀粉積累過多，分配到根中的碳水化合物少，從而抑制根的伸長［9］。也有分析認為:海藻糖抑制擬南芥幼苗生長是由于6－磷酸海藻糖積累的緣故。在加海藻糖培養(yǎng)基上生長的擬南芥植株會迅速積累6－磷酸海藻糖，抑制生長，而相同培養(yǎng)基上生長的轉磷酸海藻糖水解酶基因的擬南芥植株，生長發(fā)育正常。在培養(yǎng)基中添加可代謝糖，可緩解6－磷酸海藻糖積累對生長的抑制［4］。突變體的研究發(fā)現(xiàn)擬南芥海藻糖合成酶基因AtTPS1是植株由營養(yǎng)生長轉入生殖生長所必需的，Tps1突變體不能發(fā)育出成熟種子［5］。

把大腸肝菌的6－磷酸海藻糖合成酶基因OtsA轉入煙草中，轉基因植株與野生型相比，海藻糖合成增加了，并在表型上產生一些變化，植株變小，葉被針形，葉變薄，葉色變得暗綠，并且衰老加快［22］。酵母TPS1基因轉入煙草中，轉基因植物葉和根中積累了低水平海藻糖。轉基因植物在轉錄水平上控制Rabisco酶N亞基的啟動子，使得轉基因植株的生長明顯地被阻礙了［23］。單一轉化大腸桿菌的TPS基因和TPP基因，或者兩者同時轉化的植株表型都會變化。但是在水稻中轉入TPS和TPP的融合體。表達的融合體酶有高效專一的催化效率，使該實驗成為引人矚目的高效合成海藻糖的方法;它還有一個優(yōu)點降低了6－磷酸海藻糖的含量。在這個實驗中轉化植株產生了高水平的海藻糖，但是沒有引起生長受阻和明顯的表型變化［24］。

2.2 海藻糖與糖代謝途徑有相互作用

海藻糖不僅介入貯藏碳水化合物(淀粉、果聚糖)的合成調控［25］，而且還作用在單糖的互變和酵解上［10］。海藻糖調節(jié)著糖代謝的途徑。海藻糖代謝的基因調節(jié)與糖信號途徑的相互作用，能增強光合能力［26］。蔗糖的添加促進大豆根中蔗糖的合成。在加海藻糖和有效酶素A時，也刺激蔗糖的合成。而添加葡萄糖時，卻沒有這種促進作用［27］。

酵母TPS1有控制糖酵解糖流的作用，研究發(fā)現(xiàn)6－磷酸海藻糖對己糖激酶有抑制作用，6－磷酸海藻糖與流進入糖酵解的糖流量有強烈的相關性［28］。6－磷酸海藻糖能調控糖代謝［29］，但它不只限于控制己糖激酶活性這個方式［16］。6－磷酸海藻糖是酵母己糖激酶HXK2的有效抑制劑，但不能抑制擬南芥AtHXK1和AtHXK2［30］。擬南芥胚芽成熟的研究中發(fā)現(xiàn)，TPS1是擬南芥胚芽成熟所必須。Tps1突變體胚芽形態(tài)發(fā)育正常，但發(fā)育滯緩。在細胞膨大時，蔗糖水平會快速增長。在離體培養(yǎng)中，通過降低蔗糖水平，可以部分使tps1胚芽回復正常，但6－磷酸海藻糖不是AtHXK1或AtHXK2表達的抑制劑，也不降低己糖激酶活性。表明海藻糖代謝中的酶是植物胚芽發(fā)育的糖代謝所必須的。它不是通過己糖激酶的方式進行調控的［31］。

2.3 海藻糖與蔗糖感受機制

海藻糖不僅代謝上類似于蔗糖，在糖感受機制上也很類似于蔗糖。海藻糖代謝與植物中的糖感受機制有關［32］。植物中的糖感受可分為依賴于己糖激酶的感受和不依賴于己糖激酶的感受，不依賴己糖激酶的感受又包括蔗糖信號感受。在大麥的果聚糖合成過程中，果聚糖6－果糖基轉移酶(6－SFT)是一個關鍵酶，能被碳水化合物強烈調控。用不同碳水化合物補充給葉片切段培養(yǎng)，并測定6－SFT酶活性及果聚糖含量，發(fā)現(xiàn)蔗糖處理時，酶活性及果聚糖含量都是最高的，蔗糖既是底物又是酶激活劑，海藻糖對酶活性的作用僅次于蔗糖處理，但果聚糖積累少。果糖和葡萄糖也能刺激6－SFT酶活性，但作用大大低于蔗糖與海藻糖。用能被己糖激酶磷酸化但不進入代謝的甘露糖或2－脫氧葡萄糖處理時，對果聚糖合成不起刺激作用，但用甘露糖加海藻糖時，強烈刺激了果聚糖和淀粉的合成。表明糖對大麥果聚糖合成調節(jié)是不依賴己糖激酶的，可能是以蔗糖的感受為基礎。海藻糖在許多方面與蔗糖相似，海藻糖能代替蔗糖調節(jié)6－SFT活性。海藻糖能被海藻糖酶分解成葡萄糖，有效霉素A是海藻糖酶的有效抑制劑，在加與不加有效霉素A的情況下，海藻糖調節(jié)6－SFT的活性幾乎無差別。也說明是海藻糖而不是海藻糖的分解物葡萄糖在調節(jié)6－SFT活性［25］。蔗糖和海藻糖在糖感受調控基因表達中有相似的作用，而海藻糖酶抑制劑比轉化酶抑制劑易得到。在研究糖介導基因表達中，海藻糖可成為了一個很有用的工具。

2.4 海藻糖與蔗糖代謝酶調節(jié)

植物中的海藻糖與蔗糖相似，還表現(xiàn)在各自代謝的酶的活性調節(jié)上。糖產生的信號通常要進入信號轉導的級聯(lián)放大途徑，由蛋白激酶、蛋白磷酸酶、鈣調蛋白等的介入調控多種酶的活性，從而導致了植物的多種反應。SnRK是植物中的一類蛋白激酶，它分為3個亞族(SnRK1、2、3)。腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)被認為是淀粉合成途徑中的關鍵酶。蔗糖能調節(jié)AGPase活性，這種調節(jié)涉及SnRK1信號途徑，AGPase位于SnRK1的下游。海藻糖也能調節(jié)淀粉合成，6－磷酸海藻糖調節(jié)淀粉合成是通過還原活化AGPase完成［33］。SnRK1還可在轉錄水平上調控蔗糖合成酶基因的表達從而控制碳水化合物代謝。擬南芥中的Akin10，Akin11是SnRK1的同源基因。海藻糖可以上調Akin11基因表達，這種上調與6－磷酸海藻糖正相關。TPS蛋白占據(jù)多個SnRK1的磷酸化位點，Akin10過量表達會誘導TPS基因表達［34］。

14－3－3 是一個調節(jié)蛋白家族，14－3－3蛋白在信號轉導過程中發(fā)揮著重要作用。植物中TPS能與14－3－3蛋白結合［35］。親合色譜分析得出，TPS和SPS這些蛋白質有磷酸化位點與14－3－3蛋白結合，在植物中調節(jié)這些酶活性［36］。植物中硝酸還原酶(NR)的活性調節(jié)是通過特殊的絲氨酸殘基上的磷酸化而控制的。如在波菜中，543號絲氨酸的磷酸化可改變其活性。有活性的NR可通過蛋白激酶作用生成有活性的磷酸化的NR。而磷酸化的NR就能與14－3－3蛋白結合，結合之后的復合物沒有活性，它又可以通過蛋白磷酸酶生成有活性的NR。植物中NR、SPS、SS和羥甲基戊二酰輔酶A還原酶能被SnRK1磷酸化。之后結合上14－3－3蛋白能導致快速調節(jié)酶活性和代謝途徑。蔗糖代謝中的SPS、SS以這種方式調控，對應的海藻糖代謝中的TPS也以這種方式調控其活性。

海藻糖在食品加工、藥品保存、植物抗逆性研究上都有許多文獻報道及實際的應用。而我們則更為關注它在植物生長、發(fā)育及代謝調控中的作用。蔗糖和海藻糖都是雙糖，它們有許多相似的地方，但海藻糖在低等生物中廣泛存在，在高等植物中也有其代謝。在高等植物中它不如蔗糖那樣常見?？赡芎Ｔ逄堑倪M化起源更早。在高等植物中許多基因的表達受糖的調控。蔗糖也能調控許多代謝酶。蔗糖在高等植物中功能很多，而且易被蔗糖酶(轉化酶)分解為己糖，而且蔗糖酶的抑制劑不易獲得。這使蔗糖信號研究作用工作復雜化，海藻糖的有效抑制劑易獲得，并已有廣泛的應用。把海藻糖作為研究糖信號的一個有用工具，用作一種糖類似物，將為糖信號的感受及轉導的詳細過程的研究提供一個新視角。

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