張玉潔，和澤高，唐龍山，常 征，陳中堅(jiān)，張 鐵

(1.文山學(xué)院生化系，云南文山663000;2.文山州生物資源開(kāi)發(fā)研究中心，云南文山663000;3.文山苗鄉(xiāng)三七實(shí)業(yè)有限公司技術(shù)中心，云南文山663000)

三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)為五加科人參屬多年生草本植物，是名貴中藥材，是我國(guó)特有植物種類(lèi)。由于對(duì)環(huán)境要求的特殊性，三七主要集中分布于云南和廣西。其中，云南是目前公認(rèn)的三七道地藥材的主產(chǎn)區(qū)，占三七年產(chǎn)量的95%［1－2］。植物內(nèi)生真菌是生長(zhǎng)于植物根、莖、葉等組織的細(xì)胞間隙或細(xì)胞內(nèi)的一類(lèi)真菌，是植物微生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成成分。迄今所研究的植物體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)存在內(nèi)生真菌，少則十幾種，多則幾百種［3］。植物內(nèi)生菌長(zhǎng)期生活在寄主植物體內(nèi)，并與植物協(xié)同進(jìn)化，在演化過(guò)程中形成了密切的互惠共生關(guān)系［4］。內(nèi)生菌對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育和系統(tǒng)演化發(fā)揮重要作用，如促進(jìn)寄主植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用［5］、產(chǎn)生激素促進(jìn)植物生長(zhǎng)［6］、提高寄主適應(yīng)逆境包括抗旱、抗寒、抗鹽堿、耐高溫等的能力［7］、協(xié)助植物抵抗病蟲(chóng)害［8］、增強(qiáng)植物抗重金屬的能力［9］等。此外，“內(nèi)共生理論”認(rèn)為生物次生代謝過(guò)程中生化途徑的連續(xù)演化會(huì)導(dǎo)致有益物質(zhì)進(jìn)入到共生體中。因此，宿主體內(nèi)的個(gè)別內(nèi)生菌產(chǎn)生與宿主相同或相似的生理活性成分是由于兩者的長(zhǎng)期共生關(guān)系導(dǎo)致宿主可能將其遺傳物質(zhì)或信息傳遞給其內(nèi)生真菌，使之具有與宿主相同或相似的代謝途徑并產(chǎn)生具有相同或類(lèi)似結(jié)構(gòu)的活性產(chǎn)物［10］。為了研究三七內(nèi)生菌的生理生態(tài)功能，本文首先對(duì)三七內(nèi)生真菌進(jìn)行了初步分離和鑒定。

1 材料

三七采自文山縣苗鄉(xiāng)三七實(shí)業(yè)有限公司硯山基地，分別采集一年生、兩年生、三年生健康三七共48棵。

2 方法

2.1 內(nèi)生菌分離純化

內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)基為PDA－抗生素培養(yǎng)基，純化及測(cè)試菌培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。分離方法參考Silvani，et al.，(2008)［11］: 取新鮮健康三七的根、莖、葉，流水沖洗干凈后進(jìn)行表面消毒處理;處理完畢，在無(wú)菌條件下，用滅過(guò)菌的手術(shù)刀切去表層組織，將中間部分切成約0.5 cm大小接種于PDA培養(yǎng)基上，置25°C培養(yǎng);觀察材料邊緣有菌落長(zhǎng)出，將不同的菌落分別挑至PDA培養(yǎng)基中;將菌種在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，逐步進(jìn)行分離純化，直至得到純化的單菌株。將得到的菌株轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基保存。

2.2 內(nèi)生真菌的分子鑒定

將菌種接種到PDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5～10 d，視菌絲生長(zhǎng)速度不同而定。無(wú)菌過(guò)濾菌絲并取少量置于無(wú)菌研缽內(nèi)，加入適量CTAB(Cetyl Triethyl Ammonium Bromide)徹底研磨，利用CTAB法從新鮮菌絲中提取待測(cè)菌株的DNA。以所提DNA為模板利用引物 ITS5(5’－3’:GGAAGTAAAAGTCGTCACAAGG 正向)和 ITS 4(5’－3’:TCCTCCGCT-TATCGATATGC反向，White et al.1990)擴(kuò)增真菌基因組ITS序列，引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成(PAGE純化)。PCR采用 50 μL體系，反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min，然后以95℃，1 min、55℃，30 s、72℃，1 min進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物送上海生物工程公司測(cè)序。利用BLAST程序?qū)λ鶞y(cè)內(nèi)生真菌ITS序列進(jìn)行在線同源性比對(duì)。

3 結(jié)果及分析

3.1 三七內(nèi)生菌的分離

從健康三七根、莖、葉中分離并經(jīng)初步形態(tài)歸類(lèi)得158株不同的內(nèi)生真菌。

3.2 三七內(nèi)生真菌的種屬

表1 三七內(nèi)生真菌種類(lèi)

對(duì)其中92株三七內(nèi)生菌進(jìn)行了DNA提取和PCR擴(kuò)增。根據(jù)ITS序列與GenBank中的序列同源性關(guān)系，將所得菌種歸類(lèi)為表1所示19+1個(gè)屬。從表中種屬歸類(lèi)可見(jiàn)三七內(nèi)生真菌種類(lèi)多樣性豐富，同時(shí)，在植物體內(nèi)微環(huán)境中，不同的微生物能相互作用，形成一種相對(duì)穩(wěn)定的微生物菌群。其中一些是分離頻率高、數(shù)量大的優(yōu)勢(shì)種，如鐮孢霉屬、球殼菌屬和炭角屬等;而另一些屬于稀有種，如座堅(jiān)殼屬(Rosellinia sp.)、擬盤(pán)多毛孢屬(Pestalotiopsis sp.)、Setophoma sacchari(無(wú)中文名)等屬只有1株。三七根莖葉不同部位都分離到多株內(nèi)生菌，說(shuō)明內(nèi)生菌普遍存在于三七各器官中，但內(nèi)生菌在各器官中的分布差異較大，寄居于莖、葉中的內(nèi)生菌種類(lèi)和數(shù)量相對(duì)較多，而塊根中的內(nèi)生菌種類(lèi)和數(shù)量相對(duì)較少。

4 討論

三七內(nèi)生真菌優(yōu)勢(shì)種中只有孢鐮孢菌屬是常見(jiàn)的病原菌，但仍有報(bào)道某些孢鐮孢屬真菌屬于內(nèi)生菌，并可產(chǎn)生抗菌、抗腫瘤活性物質(zhì)。其它優(yōu)勢(shì)菌如毛殼菌屬(Chaetomium sp.)、粉紅粘帚霉(Gliocladium roseum)、光黑殼屬(Preussia sp.)真菌均有報(bào)道可作為多種植物病害的生防菌株［12］。其中，毛殼菌屬Chaetomium sp.真菌在自然界廣泛分布，是一類(lèi)應(yīng)用前景廣闊的植物病害生物防治菌，不僅能有效地防治多種蔬菜、林木和其它大田作物的病害，還能夠降解木質(zhì)素等難降解物質(zhì)［13］。多節(jié)孢屬的多種真菌如樹(shù)狀多節(jié)孢、明孢多節(jié)孢等有報(bào)道可以產(chǎn)生紫杉醇，指狀節(jié)叢孢菌可以捕食線蟲(chóng)［14］。植物內(nèi)生和土壤中粉紅粘帚霉屬具有抵抗多種土傳病害的作用［15］。2008年研究人員對(duì)生長(zhǎng)在南美洲熱帶雨林中的Ulmo樹(shù)中分離到一種粉紅粘帚霉(Gliocladium roseum)，并發(fā)現(xiàn)此真菌能夠直接利用纖維素產(chǎn)生混合烴柴油混合物，是綠色能源的一個(gè)全新的發(fā)現(xiàn)，目前正在研究它的生物燃料生產(chǎn)潛力。本研究除從三七中分離得到了與以上內(nèi)生真菌相似性極高的菌種外，還得到一株與GenBank中已報(bào)道的基因序列的相似性?xún)H為82%菌株，認(rèn)為是一新種。以上研究結(jié)果表明，三七內(nèi)生菌中可培養(yǎng)真菌較為豐富，是潛在的新的微生物菌種資源，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

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