李 爽李堯華* 葉懿文李 昕于 順楊 慧陳 彪

(1.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院老年病研究所神經(jīng)生物學研究室，教育部神經(jīng)變性病重點實驗室，北京100053;2.首都醫(yī)科大學北京神經(jīng)科學研究所，北京市神經(jīng)再生修復研究重點實驗室，教育部神經(jīng)變性病重點實驗室，北京100069)

含L(DLR類)A重復分揀蛋白相關受體〔sortilinrelated receptor，L(DLR class)A repeats-containing，SORL1〕是一種Ⅰ型跨膜蛋白，相對分子質(zhì)量約為250000。在腦內(nèi)，SORL1大量存在于海馬、齒狀回和大腦皮質(zhì)的神經(jīng)細胞內(nèi)［1］。研究［2］顯示SORL1與淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)的加工、處理過程相關，如抑制SORL1的活性，神經(jīng)元內(nèi)就會產(chǎn)生更多數(shù)量的β淀粉樣蛋白。另外，sorl1基因多態(tài)性與阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)相關，特別是在散發(fā)性AD患者的腦脊液中發(fā)現(xiàn)SORL1蛋白表達水平明顯下降［3-4］。因此，普遍認為SORL1是繼載脂蛋白E ε4(apolipoprotein E epsilon 4，APOE ε4)之后發(fā)現(xiàn)的與散發(fā)性AD關系較為密切的風險因子之一［5］。本實驗將人sorl1 cDNA 5 923～6 260 bp片段亞克隆至原核表達載體，研究了sorl1 cDNA片段在原核細胞中的表達過程，制備了高純度基因重組人SORL1蛋白質(zhì)片段，為制備抗SORL1抗體提供樣品保障。

1 材料和方法

1.1 材料

質(zhì)粒pET-28a(+)為本實驗室保存;限制性核酸內(nèi)切酶NcoⅠ和SalⅠ、DNA Ligation Kit購自大連寶生物工程有限公司;Gel Extracton Kit購自美國Omega公司;質(zhì)粒小提試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;蛋白定量試劑盒(BCA protein assay Kit)購自美國Pierce公司;感受態(tài)細菌DH 5α和BL21(DE3)plysS購自北京鼎國生物公司。人sorl1 cDNA由美國加利福尼亞大學馬秋蘭教授惠贈。

1.2 引物設計及PCR擴增

參照Genebank中NM003105.4的mRNA序列設計上游引物序列為：5'-CGCCATGGTGGTCATCAAGTGGGAAT-3'，下游引物序列為：5'-CGCGTCGACTCACTCATAGCCCCTGCTT-3'。在兩引物中分別導入NcoⅠ和SalⅠ限制性核酸內(nèi)切酶位點序列。以人sorl1 cDNA為模板，按照如下程序擴增目的DNA：95℃ 40 s，56℃ 40 s，72℃ 1 min，循環(huán)數(shù)為30。

1.3 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后回收其358 bp片段。把純化后的DNA片段和pET-28a(+)空載質(zhì)粒分別經(jīng)內(nèi)切酶NcoⅠ和SalⅠ消化。將酶切后的PCR產(chǎn)物與線性pET-28a(+)回收，用DNA Ligation Kit在16℃下連接30 min，轉(zhuǎn)化至DH 5α感受態(tài)細菌中，涂布于含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中，次日挑取單一菌落進行小培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并測序。

1.4 重組質(zhì)粒的原核細胞表達

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)plysS感受態(tài)細菌，挑取單一菌落，接種至10 mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，230 r/min振蕩16 h。取2.5 mL培養(yǎng)液接種至250 mL含有卡那霉素(1∶1 000)的2× YTA培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)3 h后，加入異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖(isopropyl beta-D-thiogalactopy ranoside，IPTG)誘導轉(zhuǎn)化菌4 h。離心收集細菌沉淀，用預冷的Tris-HCl(20 mmol/L)-EDTA(1 mmol/L)懸浮，超聲破碎(工作2 s，間隔2 s，10 min)，離心(4℃，10 000 g，30 min)后SDS-PAGE分析。

1.5 包涵體的洗滌與溶解

包涵體組分分別用緩沖液Ⅰ(50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)、Ⅱ(緩沖液Ⅰ+1%Triton-X 100)和Ⅲ(緩沖液Ⅰ+2 mol/L尿素)4℃下洗滌30 min，離心(4℃，10 000 g，30 min)棄上清。加入緩沖液Ⅳ(緩沖液Ⅰ+8 mol/L尿素)，冰浴攪拌1 h，離心收集上清。

1.6 重組蛋白的純化

將溶解的包涵體組分應用 TSK-GEL G3000 SWXL色譜柱分離。流動相：50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，8 mol/L尿素，pH 8.0?；厥漳繕说鞍踪|(zhì)組分，用PBS透析過夜。蛋白定量采用BCA法，以牛血清白蛋白為標準。

2 結(jié)果

2.1 人sorl1 cDNA 5 923～6 260 bp片段的擴增

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離可見約358 bp大小。純化和回收擴增產(chǎn)物并與pET-28a(+)連接。對重組質(zhì)粒測序結(jié)果證明，亞克隆的cDNA全長 358 bp，編碼 113個氨基酸，與 Genebank中NM003105.4的mRNA的5 923～6 260 bp區(qū)完全相同(圖1)。

圖1 人sorl1 cDNA片段核苷酸序列及編碼氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the human sorl1 cDNA fragmentsorl1：sortilin-related receptor，L(DLR class)A repeats-containing.

2.2 重組質(zhì)粒的原核表達

重組質(zhì)粒在BL21(DE3)plysS細菌中的表達量隨IPTG誘導的時間遞增，且存在于細菌的包涵體組分中(圖2)。

圖2 重組質(zhì)粒在原核細胞中的表達Fig.2 Prokaryotic expression of PET-28a(+)-human sorl1 cDNA 5 923～6 260 bpEach sample(5 μL)was separated with SDS-PAGE and stained by coomassie brilliant blue R250.Lane 0～4：bacterial lysate，induced-time(0～4 h)with IPTG;Lane 5：the soluble fraction of bacterial lysate;Lane 6：the insoluble fraction of bacterial lysate(inclusion bodies fraction);Lane7：inclusion bodies dissolved in 8mol/L urea;Lane 8：the purified recombinant protein by column chromatography;M：protein standard molecular weight marker;sorl1：sortilin-related receptor，L(DLR class)A repeats-containing.

2.3 重組蛋白的純化

經(jīng)8 mol/L尿素處理后的重組蛋白通過TSKGEL G3000 SWXL色譜柱的保留時間為18 min(圖3);純化的目的蛋白在SDS－PAGE上表現(xiàn)為單一條帶(圖2)。每500 mL細菌培養(yǎng)液可獲得重組蛋白約為24 mg。

圖3 重組蛋白的純化Fig.3 Purification of the recombinant proteinArrow：the peak of target protein separated by TSK-GEL G3000 SWXL column chromatography.

3 討論

SROL1是一個多區(qū)域蛋白，且與低密度脂蛋白受體同源，具有物質(zhì)運輸、分子伴侶、信號轉(zhuǎn)導以及蛋白分選等多種生物學功能。雖然受到遺傳異質(zhì)性的影響，但是包括中國漢族人群在內(nèi)的多種族、多中心遺傳學研究［6-8］支持sorl1基因多態(tài)性與AD密切相關。APP的蛋白水解過程一直被認為是AD發(fā)病中心環(huán)節(jié)［9］。位于反面高爾基體網(wǎng)(trans-Golgi-network，TGN)的SORL1與調(diào)節(jié)蛋白共同作用調(diào)控APP的靶向運輸，阻止其進入β淀粉樣蛋白(amyloid protein β，Aβ)生成途徑［10］。過表達的SORL1可以引起APP重新分布到高爾基體，減少Aβ的產(chǎn)生，而在基因敲除小鼠模型中，APP的水解代謝增加、Aβ異常積聚，促進老年斑的形成［11-12］。另外，SORL1富含于腦內(nèi)神經(jīng)元，研究［13-14］顯示在散發(fā)性AD患者中，其神經(jīng)細胞內(nèi)的SORL1蛋白含量明顯減少，且與AD病理易損區(qū)(如海馬、顳葉大腦皮質(zhì))的淀粉數(shù)斑塊數(shù)量呈負相關。最重要的是，在伴有輕度認知障礙(mild cognitive impairment，MCI)的癥狀前 AD患者中同樣也發(fā)現(xiàn)SORL1蛋白水平已有下降，表明SORL1的病理性改變是散發(fā)性AD的早期事件，同時也是Aβ產(chǎn)生的始動因素［15-16］。因此，監(jiān)測體內(nèi)SORL1蛋白含量可能成為一種新的早期診斷散發(fā)性AD的生物標記物。

sorl1基因位于11q23.2-24.2，其cDNA包含一個6 639 bp的開放閱讀框，編碼2 214個氨基酸。本研究采用了基因工程技術重組了人sorl1基因片段，選用的載體是 pET-28a(+)原核表達載體。依據(jù)人sorl1 cDNA編碼氨基酸的親、疏水性先后選擇了3個親水性較強的候選片段，利用載體中NcoⅠ酶切位點中的起始密碼ATG序列設計引物。3個重組質(zhì)粒測序證實閱讀框無誤后，SDS-PAGE結(jié)果顯示其中兩個重組質(zhì)粒在大腸桿菌不表達(結(jié)果未展示)，只有pET-28a(+)-human sorl1 cDNA 5 923～6 260 bp在IPTG的誘導下，一個分子量約13 000的蛋白質(zhì)開始表達并呈現(xiàn)時間依賴性遞增，而且表達的目標蛋白以包涵體的形式存在于細菌沉淀中。本課題組應用8 mol/L尿素溶解包涵體，并將其進行凝膠過濾層析、透析復性等處理，最后通過SDS-PAGE電泳鑒定，證實目的蛋白純化成功，為制備抗SORL1抗體并探討AD的發(fā)病機制奠定了基礎。

［1］ Yamazaki H，Bujo H，Kusunoki J，et al.Elements of neural adhesion molecules and a yeast vacuolar protein sorting receptor are present in a novel mammalian low density lipoprotein receptor family member［J］.J Biol Chem，1996， 271(40)：24761-24768.

［2］ Marx J.Molecular biology.Trafficking protein suspected in Alzheimer’s disease［J］.Science，2007，315(5810)：314.

［3］ Lee J H，Cheng R，Schupf N，et al.The association between genetic variants in SORL1 and Alzheimer disease in an urban，multiethnic，community-based cohort［J］.Arch Neurol，2007，64(4)：501-506.

［4］ Dodson S E，Gearing M，Lippa C F，et al.LR11/SORLA expression is reduced in sporadic Alzheimer disease but not in familial Alzheimer disease［J］.J Neuropathol Exp Neurol，2006，65(9)：866-872.

［5］ Rogaeva E，Meng Y，Lee J H，et al.The neuronal sortilinrelated receptor SORL1 is genetically associated with Alzheimer disease［J］.Nat Genet，2007，39(2)：168-177.

［6］ Reitz C，Cheng R，Rogaeva E，et al.Meta-analysis of the Association between variants in SORL1 and Alzheimer disease［J］.Arch Neurol，2011，68(1)：99-106.

［7］ Tan E K，Lee J，Chen C P，et al.SORL1 haplotypes modulate risk of Alzheimer’s disease in Chinese［J］.Neurobiol Aging，2009，30(7)：1048-1051.

［8］ Ning M，Yang Y，Zhang Z，et al.Amyloid-beta-related genes SORL1 and ACE are genetically associated with risk for late-onset Alzheimer disease in the Chinese population［J］.Alzheimer Dis Assoc Disord，2010，［Epub ahead of print］.

［9］ De Strooper B，Annaert W.Proteolytic processing and cell biological functions of the amyloid precursor protein［J］.J Cell Sci，2000，113(Pt 11)：1857-1870.

［10］Schmidt V，Sporbert A，Rohe M，et al.SORLA/LR11 regulates processing of amyloid precursor protein via interaction with adaptors GGA and PACS-1［J］.J Biol Chem，2007，282(45)：32956-32964.

［11］Andersen O M，Reiche J，Schmidt V，et al.Neuronal sorting protei-related receptor SORLA/LR11 regulates processing of the amyloid precursor protein［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2005，102(38)：13461-13466.

［12］Dodson S E，Andersen O M，Karmali V，et al.Loss of LR11/SORLA enhances early pathology in a mouse model of amyloidosis：evidence for a proximal role in Alzheimer’s disease［J］.J Neurosci，2008，28(48)：12877-12886.

［13］Scherzer C R，Offe K，Gearing M，et al.Loss of apolipoprotein E receptor LR11 in Alzheimer disease［J］.Arch Neurol，2004，61(8)：1200-1205.

［14］程忻，董強，申勇.散發(fā)性阿爾茨海默病患者腦內(nèi)SORLA水平與淀粉樣斑塊數(shù)量的關系［J］.神經(jīng)損傷與功能重建，2009，4(2)：94-97.

［15］Sager K L，Wuu J，Leurgans S E，et al.Neuronal LR11/ SORLA expression is reduced in mild cognitive impairment［J］.Ann Neurol，2007，62(6)：640-647.

［16］Grear K E，Ling I F，Simpson J F，et al.Expression of SORL1 and a novel SORL1 splice variant in normal and Alzheimer’s disease brain［J］.Mol Neurodegener，2009，4：46.