孫永杰

高血糖大鼠藍斑核神經(jīng)原一氧化氮合酶的改變

孫永杰

目的觀察高血糖大鼠藍斑核NOS陽性反應(yīng)物的變化。方法用腹腔注射四氧嘧啶法建立高血糖大鼠動物模型。用酶組織化學(xué)和圖像分析方法觀察大鼠藍斑核NOS細胞的變化。結(jié)果高血糖大鼠藍斑核NOS細胞陽性反應(yīng)物減弱(P＜0.01)。結(jié)論NOS陽性反應(yīng)物減少與高血糖的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

高血糖;藍斑核;一氧化氮合酶;大鼠

一氧化氮是一種神經(jīng)遞質(zhì)，也是一種重要生理功能的信使分子，既溶于水又溶于脂，是非?；钴S的化學(xué)物質(zhì)，參與多種生理過程。一氧化氮系在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化下由L-精氨酸氧化產(chǎn)生，一氧化氮合酶是一氧化氮合成的關(guān)鍵因素［1］，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。目前，已有許多研究表明，藍斑核所含去甲腎上腺素能神經(jīng)元群，通過上、下行投射，幾乎終止于全腦和脊髓灰質(zhì)各部，從而影響腦的整體活動，如:控制注意力水平;調(diào)節(jié)覺醒-睡眠周期;參與胃腸道和呼吸道反射;參與介導(dǎo)所在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的心血管、血壓和化學(xué)感受器反射，并對痛覺傳遞進行調(diào)制等［2］。但關(guān)于高血糖時藍斑核內(nèi)NOS的含量是否發(fā)生改變尚未見報道。

1 資料與方法

1.1 實驗材料 雄性Wistar大鼠(中國醫(yī)科大學(xué)動物室提供)，NADPH-d、四硝基唑藍(NBT)、TritonX-100(購于 Sigma

公司);四氧嘧啶(購于Sigma公司);LUZEX-F顯微圖像分析儀(日本，松下公司);日立H-600透射電鏡。

1.2 實驗動物分組 本實驗選用雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量260～300 g，隨機分成2組。正常對照組:20只。實驗組:20只。

1.3 實驗方法

1.3.1 高血糖大鼠模型制備 實驗動物禁食12 h。實驗組腹腔一次注射200 mg/kg四氧嘧啶，正常對照組注射等體積的0.9%氯化鈉注射液。6周后取材。

1.3.2 組化標本制備 對實驗動物用1%戊巴比妥鈉(40 ml/kg)腹腔麻醉后開胸，經(jīng)左心室70滴/min滴入1%肝素鈉的0.9%氯化鈉注射液500ml，同時剪開右心耳。繼用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)配制的固定液(含4%多聚甲醛)灌流固定。取出實驗動物的大腦組織，放入含4%多聚甲醛PBS的固定液中進行后固定大約2 h，之后將實驗動物的大腦組織切成薄片移入含20%蔗糖的PBS中。在4℃冰箱中存放，至組織薄片沉底，經(jīng)水包埋，恒冷箱連續(xù)橫切片，片厚20 μm。經(jīng)OCT包埋，恒冷箱連續(xù)切片，片厚16 mm，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 尼氏染色 冰凍切片吹干，經(jīng)PBS漂洗5min×3次，將切片置入1%甲苯胺藍溶液中37℃孵育90min，取出后用蒸餾水沖洗，PBS漂洗5min×3次，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.3.4 一氧化氮合酶組織化學(xué)方法 染色方法:NOS酶組織化學(xué)染色:在2 g/LTritonX-100磷酸緩沖液中預(yù)孵育5～10 min(室溫);在下列孵育液中反應(yīng)2 h(37℃):NADPH-d 10 mg，四硝基唑藍(NBT)5 mg ，TritonX-100 0.03 ml，用0.1 mol/L PBS新鮮配制成100 ml;用PBS終止反應(yīng)、漂洗;梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.5軟件包進行統(tǒng)計分析，計量資料采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 尼氏染色結(jié)果 正常對照組大鼠藍斑核區(qū)的尼氏染色切片上，神經(jīng)元數(shù)量較多，排列緊密，形態(tài)完整，泡漿內(nèi)尼氏體豐富。實驗組，正常神經(jīng)元數(shù)量減少，細胞皺縮，有的溶解成碎片。

2.2 NOS酶組化結(jié)果 正常對照組和實驗照組NOS陽性反應(yīng)物分布于藍斑核，多為錐體細胞，陽性反映物呈深蘭色，分布在細胞質(zhì)及突起，胞核不著色。實驗組，NOS陽性細胞數(shù)量減少，其形態(tài)不同于正常NOS陽性細胞，細胞小，突起少，著色淺且大部分局限于細胞膜。見圖1。

圖1 高血糖大鼠藍斑核區(qū)單位面積NOS陽性物平均灰度值

3 討論

目前已知NOS有二類:原生型NOS(cNOS)和誘導(dǎo)型(iN-OS)［3］。在生理狀態(tài)下cNOS參與各種活動的調(diào)節(jié)，其作用時間短，生成的一氧化氮少。iNOS在正常生理狀態(tài)下表達較少，但在病理狀態(tài)下，經(jīng)某些細胞因子和內(nèi)毒素等的誘導(dǎo)，表達增多，iNOS的作用時間長，可催化產(chǎn)生大量的一氧化氮。在實驗中，我們觀察到，大鼠藍斑核NOS酶反應(yīng)陽性細胞及纖維數(shù)量顯著減少，結(jié)果提示NOS可能參與高血糖的病理生理過程，可作為神經(jīng)元受損的標示物。

［1］ Bolanos JP，Almeida A.Roles of nitric oxide in brain hypoxiaischemia.Biophys Acta，1999，1411:415-436.

［2］ 柏數(shù)令.系統(tǒng)解剖學(xué).人民衛(wèi)生出版社，2008:345.

［3］ Carthwoite J.Clutamate，nitric oxide and cell-cell signalling in the nervous system.Trends Neurosci，1991，14:60-67.

Investigation on the change of nitric oxide synthetase positive neurons in locus ceruleus of rats with hy-perglycemia

SUN Yong-jie.
Liaoning Health College of Vocational Technology Shen Yang 110101，China

ObjectiveTo observe the expression of nitric oxide synthetase(NOS)in Locus Ceruleusneurons with hyperglycemia.MethodsNADPH-d histochemical method was used.ResultsNOS positive neurons expressed in Locus Ceruleus and nomal neurons of 6 weeks old rats with hyperglycemia(DM)and normal rats(NC).There was significant difference in neurons between DM group and control group.ConclusionThere is a relationNOS positive neurons decrease in Locus Ceruleus of rats with hyperglycemia.

Hyperglycemia;Locus ceruleus;NOS;Rat

110101遼寧衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院

·臨床醫(yī)學(xué)·