張金龍 ，王海娟 ，路 中 ，劉 健 ，林 晨 ，錢海利 *，李貴新 *

1.濰坊醫(yī)學院，山東濰坊 261053；2.北京協(xié)和醫(yī)學院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所分子腫瘤學國家重點實驗室，北京 100021

Oct4在多種人腺癌組織中表達水平的研究

張金龍1，王海娟2，路 中1，劉 健2，林 晨2，錢海利2*，李貴新1*

1.濰坊醫(yī)學院，山東濰坊 261053；2.北京協(xié)和醫(yī)學院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所分子腫瘤學國家重點實驗室，北京 100021

目的：研究5種人腺癌中Oct4的表達情況，為進一步探索其在腫瘤發(fā)生中的機制提供基礎。方法：應用乳腺癌、胃癌、胰腺癌、腸癌、子宮內膜癌5種腺癌的組織芯片，通過免疫組織化學染色研究Oct4蛋白在組織中的表達情況，并與癌旁正常組織進行比較。結果：Oct4在5種腺癌腫瘤組織內均有表達，胃癌組織內Oct4的表達高于癌旁正常組織（P<0.05），其他腺癌組織中Oct4的表達與癌旁組織差異無統(tǒng)計學意義；在乳腺癌和腸癌中，無淋巴結轉移患者的腫瘤組織中Oct4表達高于淋巴結轉移患者的腫瘤組織（P<0.05），而在胃癌、胰腺癌及子宮內膜癌患者中未觀察到這種差異；5種腺癌的腫瘤組織內，未發(fā)現(xiàn)Oct4的表達與臨床分期有關。Oct4在癌旁正常組織中（子宮內膜癌除外）主要定位于細胞漿，而在腺癌組織中既表達于細胞核，也表達于細胞漿。結論：Oct4的表達可能是腫瘤發(fā)生過程中的早期事件，不同腺癌組織中Oct4的表達情況不完全相同，Oct4的核/漿表達模式可能與其在腫瘤發(fā)生中的作用有關。

Oct4；腺癌；組織芯片；免疫組織化學

Oct4（也稱為 Oct3/4、POU5F1、OTF3、OTF4）是 POU 家族的成員，與細胞的生長及分化有關，通常認為其表達與胚性細胞的多能性有關，是細胞干性狀態(tài)的標志[1]。腫瘤細胞是處于不同去分化程度的異質性細胞群。新近的研究表明，腫瘤的發(fā)生和進展是由于其中存在一小部分具有不斷自我更新、分化和高度致瘤能力的細胞，即腫瘤干細胞。這部分腫瘤干細胞是腫瘤復發(fā)和耐藥的根源。因此，腫瘤的干性狀態(tài)決定著腫瘤治療的敏感性和最終結局。Oct4作為多功能因子在腫瘤和干細胞的生物學方面具有潛在致癌性，也是細胞自我更新及分化的調節(jié)器[2]，并且認為Oct4在維持腫瘤干細胞的性質及抵抗性方面具有重要的作用[3]。因此，本文通過研究5種腺癌包括乳腺癌、胃癌、胰腺癌、腸癌、子宮內膜癌中Oct4的表達情況，探討Oct4在腺癌發(fā)生過程中的潛在作用，并為未來的腫瘤干細胞機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

腺癌組織芯片臨床病理資料：腺癌組織芯片由中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院病理科呂寧教授提供。芯片共包含150例腺癌患者的組織樣本，就診時間為2002～2003年。乳腺癌、胃癌、胰腺癌、腸癌、子宮內膜癌各30例（芯片處理過程中有個別樣本脫落現(xiàn)象，以獲得實際結果的樣本數為準），每種系統(tǒng)腫瘤均包括5例癌旁組織。

1.2 試劑

兔抗人Oct4多克隆抗體（abcam，ab19857），第二代通用型二步法檢測系統(tǒng)（PV9000，北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學染色步驟 采用免疫組織化學通用型二步法。PBS代替一抗作為陰性對照，山羊IgG按照5μg/m l稀釋代替一抗作為同型對照，精原細胞瘤組織作為陽性對照。組織芯片常規(guī)脫蠟至水，EDTA抗原修復液（pH=8.0）行熱修復，3%H2O2孵育30min，山羊血清封閉10 min。滴加Oct4（1∶250）4℃過夜，滴加增強劑室溫孵育 25min，滴加二抗室溫孵育25 min，DAB顯色，蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，脫水，封片。鏡檢。

1.3.2 免疫組織化學評分 Oct4在細胞核、細胞漿中均有表達，分別評分。評分標準如文獻[4]所述，按陽性細胞數分為：陽性細胞數＜5%為0分；陽性細胞數5%～25%為1分；陽性細胞數26%～50%為2分；陽性細胞數51%～75%為3分；陽性細胞數＞75%為4分。按染色強度分為：基本未著色、著色與背景相似者為0分；著色淺略高于背景者為1分；中度著色、明顯高于背景者為2分；強染、呈深棕色者為3分。對每一組織點來說，用陽性細胞數評分與染色強度的乘積為最終評分，0～4 分為弱表達，5～8 分為中等表達，9～12 分為強表達。綜合染色強度和細胞數量進行分級，取表達最強的部分。

1.4 統(tǒng)計學分析

所得數據采用SPSS 16.0軟件進行分析，差異采用非參數檢驗，相關性分析采用秩相關，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Oct4在不同腫瘤組織中的表達情況（圖1）

Oct4在乳腺癌腫瘤組織內有表達，而癌旁組織未見表達。胃癌的癌旁組織的表達高于腫瘤組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），腸癌、子宮內膜癌、胰腺癌腫瘤組織與癌旁組織Oct4的表達差異無統(tǒng)計學意義。

2.2 Oct4的表達與腫瘤臨床分期的關系（表1）

5 種腺癌的腫瘤組織內，未發(fā)現(xiàn)Oct4的表達與臨床分期相關，并且早期（Ⅰ～Ⅱ期）與進展期（Ⅲ期）患者Oct4的表達無差異。

2.3 Oct4的表達與淋巴結轉移的關系（表1）

5 種腺癌的腫瘤組織內，乳腺癌、腸癌未出現(xiàn)淋巴結轉移患者比出現(xiàn)淋巴結轉移患者Oct4的表達高，Oct4的表達與淋巴結轉移情況無相關性。胃癌、胰腺癌及子宮內膜癌患者Oct4的表達無差異。

2.4 Oct4在細胞核、細胞漿的表達情況（表2、圖2）

Oct4在不同腫瘤中的核/漿表達模式不完全相同。乳腺癌患者腫瘤組織細胞核表達而細胞漿不表達者3例，占10.00%（3/30），細胞漿表達而細胞核不表達者2例，占6.67%（2/30），癌旁組織不表達。胰腺癌患者腫瘤組織及癌旁組織細胞漿表達明顯高于細胞核 （P＜0.05）。胃癌患者腫瘤組織內，細胞核、細胞漿均表達者11例，占36.67%（11/30），癌旁組織僅表達于細胞漿，且癌旁組織表達高于腫瘤組織。腸癌患者腫瘤組織內細胞漿、細胞核均表達者18例，占60.00%（18/30），而癌旁組織中腺管組織內細胞核、細胞漿均有表達，間質組織中僅細胞核表達。子宮內膜患者癌腫瘤組織細胞核、細胞漿均有表達者21例，占70.00%（21/30），癌旁組織只在細胞核表達，細胞漿不表達。

表1 Oct4的表達與5種腺癌的臨床病理參數的關系Tab.1 The correlation between Oct4 expression and the clinicaland pathologicalparam eters in 5 types of adenocarcinoma

表2 Oct4在5種腺癌腫瘤組織及癌旁組織細胞核、細胞漿表達情況Tab.2 The expression of Oct4 in the nucleus and cytoplasm of 5 types adenocarcinoma and paratum oral tissues

3 討論

Oct4是多潛能性的標志，表達于人類胚胎干細胞[5]，在分化組織內其表達量下降[6]。Oct4是少數能夠使成體細胞重編程為誘導性多能干細胞 （induced pluripotent stem cells，iPS）的細胞因子[7]。Kim[8]甚至用Oct4單個基因就能夠從成年小鼠神經干細胞誘導出多能干細胞。Hochedlinger等[1]的研究顯示Oct4本身就可能引起上皮異常增生，在成年小鼠體內，誘導Oct4的過表達可以抑制細胞分化，進而引起腸道發(fā)育異常。進一步研究顯示胰腺細胞分化過程中檢測到Oct4的表達，當胰腺干細胞分化為內分泌細胞時則檢測不到Oct4的表達。

Oct4在腫瘤形成過程中也發(fā)揮一定的作用。不僅在生殖細胞瘤中檢測到Oct4的表達[9]，在膀胱癌[10]、肺癌[11]、視網膜母細胞瘤[12]、前列腺癌[13]及許多腫瘤細胞株內均檢測到其表達。在用Oct4誘導iPS細胞時會有相當的機會產生有致瘤能力的癌變細胞。

為了明確Oct4在腫瘤、尤其是腺癌發(fā)生中的作用，我們首先對多種腺癌中Oct4的表達進行了免疫組織化學研究。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)Oct4在多種腺癌組織中均有不同程度的表達，并且在部分腺癌的癌旁組織內檢測到Oct4的表達。提示其表達可能在腫瘤的發(fā)生過程中起了重要作用。有研究顯示[14]，Oct4陽性腫瘤患者其死亡率高于陰性患者。

而且，我們未發(fā)現(xiàn)Oct4的表達與臨床分期之間的相關性，這與Wang等[15]的結果一致，但是他們發(fā)現(xiàn)Oct4與腫瘤的組織學分級有明顯的相關性，可能與其去分化有關。同樣我們也未發(fā)現(xiàn)Oct4與淋巴結轉移之間的相關性。提示Oct4可能只是腫瘤發(fā)生的一個早期事件，一旦啟動腫瘤發(fā)生以后會有更多的因素參與腫瘤的進展。

人類Oct4基因有3種剪切體[16]：Oct4A、Oct4B及Oct4B1。Oct4A主要定位于胚胎干細胞的細胞核，維持細胞的自我更新及分化潛能。在生殖細胞瘤及胚胎性腫瘤中均檢測到Oct4A表達的上調，提示其可能參與了腫瘤的形成[9,17]，而在正常體細胞中Oct4A只有較低表達，在其相應的腫瘤組織內其表達量會明顯增加[17]。Karoubi等[18]在肺腺癌中發(fā)現(xiàn)Oct4A在細胞核、細胞漿均有表達，并且腫瘤組織內的表達明顯高于正常組織。Oct4B則定位于實體瘤細胞的細胞漿，不具有自我更新能力[19]。Oct4B只在細胞漿表達，并且腫瘤組織與正常組織的表達無差異。Oct4B1不僅表達于實體瘤細胞，也高表達于ES細胞，但是在分化的細胞中其表達迅速下降[16]。Asadi等[20]在胃腺癌中檢測到Oct4B1的高表達，其作為抗凋亡因子，與腫瘤的進展有關。

我們也發(fā)現(xiàn)Oct4在5種腺癌患者腫瘤組織的細胞核、細胞漿中均有表達。乳腺癌患者的癌旁組織不表達，子宮內膜癌患者癌旁組織Oct4只表達于細胞核而細胞漿不表達，腸癌患者癌旁組織中腺管組織內細胞核、細胞漿均有表達，間質組織中僅表達于細胞核。胃癌患者癌旁組織主要表達于細胞漿，細胞核有少量表達。推測Oct4可能首先在細胞核表達，然后隨著細胞的去分化細胞漿內出現(xiàn)表達，進而導致腫瘤的發(fā)生及進展。

本研究首次檢測Oct4在多種腺癌中的表達情況，發(fā)現(xiàn)不同腺癌組織中Oct4的表達情況不完全相同，并且Oct4在細胞核、細胞漿的定位表達情況也有差異。但由于我們所收集患者例數有限，及患者臨床資料不夠完整，所以Oct4作為腺癌診斷及治療指標的價值，尚需更深入的研究證實。根據其不同剪切體表達部位及功能的不同，也有待進一步的研究，明確其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，篩選出可靠的用于臨床篩查、診斷及治療的特異性分子標志，為腫瘤的早期診斷、治療及預后監(jiān)測提供新的思路。

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Research the expression of Oct4 in multiple adenocarcinoma

ZHANGJinlong1,WANGHaijuan2,LUZhong1,LIUJian2,LINChen2,QIANHaili2*,LIGuixin1*

1.Weifang Medical University,Weifang 261053,China;2.State Key Laboratory of Molecular Oncology,Cancer Institute/Cancer Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Beijing 100021,China

Objective:To study the expression of Oct4 in adenocarcinomas from 5 tissue origins and provide insights to the Oct4-related mechanism of carcinogensis.Methods:Immuno-histochemistry staining was adopted to study the expression of Oct4 protein in adenocarcinoma tissue array containing adenocarcinoma and paratumoral samples of 5 tissue origins.Results:Oct4 was expressed in all 5 adenocarcinomas.Oct4 was significantly differently expressed in gastric-derived adenocarcinoma and paratumoral tissue (P<0.05),but not other origins.Breast and intestinal adenocarcinomaswithout lymph nodemetastasis had stronger Oct4 expression than thosewith lymph nodemetastasis （P<0.05）.However,therewas no difference of Oct4 level in gastric cancer,pancreatic cancer and endometrial cancer,no association of Oct4 expression with clinical stage was observed.Except for in endometrium tissue,Oct4 wasmainly located in cytoplasm in normal tissue,but in nucleus and cytoplasm in tumor tissue.Conclusion:The expression of Oct4may be an early event during tumorigenesis;Oct4 was expressed in different patterns in various tissues and their counterpart adenocarcinoma.The distribution of Oct4 in nuclear or cytoplasm may present its physiological or pathological function during tumorigenesis.

Oct4;Adenocarcinoma;Tissue array;Immuno-histochemistry

R730.2

A

1674-4721（2011）03（b）-017－04

國家自然科學基金面上項目（30973447）。

張金龍（1984-），男，山東沂水人；濰坊醫(yī)學院2008級在讀碩士研究生；研究方向：結腸癌干細胞。

*通訊作者

2011-01-13）