李海臣,蘭士波,羅旭

(1.黑龍江省大興安嶺地區(qū)呼中林業(yè)局營林處,呼中 165000;2.黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所經(jīng)濟林研究室,哈爾濱 150081;3.黑龍江省林業(yè)科學(xué)院)

櫻桃李(Prunus cerasiferaEhrh.)是中國珍稀瀕危生物資源和世界寶貴野生果樹資源,果肉柔軟多汁,可溶性固形物含量高,酸味濃,口感風(fēng)味獨特,具良好食用和保健價值。樹形介于灌木與喬木之間,耐寒力極強[1-2],天然分布在中亞天山、高加索、土庫曼山地、帕米爾阿賴、伊朗、小亞細(xì)亞等山區(qū),分布最東端在中國新疆伊犁。

櫻桃李莖段離體培養(yǎng)不受自然周期性和非周期性氣候條件變化的制約,且能保持原始親本的優(yōu)良性狀和特性,具有獲取遺傳增益的潛力,總而言之,莖段離體培養(yǎng)是規(guī)?；⒐S化、快速繁殖苗木的主要方式[3]。筆者以當(dāng)年萌生的幼嫩莖段為外植體,通過調(diào)整細(xì)胞分裂素和植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度配比,優(yōu)化離體培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基,提出離體培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)和示范,為徹底拯救、合理保護和創(chuàng)新利用這一珍稀種質(zhì)提供科技含量高的優(yōu)質(zhì)苗木和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 外植體選擇及消毒處理

在黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所森林培育學(xué)重點實驗室、林口縣林業(yè)局國家良種繁育基地分別開展離體培養(yǎng)及栽培馴化試驗。莖段離體培養(yǎng)繁殖材料來源于引種栽培的5年植株上當(dāng)年生幼嫩枝條,清除基部葉片,保留頂部1～2片葉,在洗潔精溶液(水∶洗潔精=1∶500)中清洗,除去表面灰塵。經(jīng)蒸餾水沖洗后,剪成1.0～2.0 cm莖段,在超凈工作臺上,用0.1%HgCl溶液表面滅菌5～7min,再用無菌水沖洗5～6次,置無菌水中浸泡40～60min。然后,切除與消毒液接觸的傷口部位,吸干材料表面水分。

1.2 培養(yǎng)基制作與培養(yǎng)環(huán)境控制

1.2.1 培養(yǎng)基制作。以MS、1/2MS、3/4MS為基本培養(yǎng)基,若無特別說明,其中均附加蔗糖30 g/L、瓊脂7 g/L。同時,根據(jù)試驗設(shè)計要求,在基本培養(yǎng)基中,分別添加不同濃度配比的細(xì)胞分裂素(6-BA、KT)和植物生長調(diào)節(jié)劑(IAA、NAA、2,4-D),并置120 ℃條件下滅菌15 min。

1.2.2 培養(yǎng)環(huán)境控制。莖段立體培養(yǎng)對環(huán)境條件要求苛刻,在整個培養(yǎng)過程中,將環(huán)境條件控制在技術(shù)要求范圍內(nèi)。⑴工莖段腋芽培養(yǎng):培養(yǎng)溫度25±1.0℃,光照時間16 h/d,光照強度2月日500 lx,pH值5.8;⑵腋芽增殖培養(yǎng):培養(yǎng)溫度25±1.0℃,光照時間12 h/d,光照強度2000 lx,相對濕度90%,pH值5.8。

1.3 培養(yǎng)基篩選和優(yōu)化

在無菌條件下,將滅菌莖段接種到添加細(xì)胞分裂素和植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度配比不同的基本培養(yǎng)基(MS)上離體培養(yǎng),以優(yōu)化莖段腋芽萌發(fā)和叢芽再生的最適培養(yǎng)基。在離體培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,將誘導(dǎo)出的叢生芽單芽的芽尖或分化苗分別轉(zhuǎn)接到含不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑的增殖培養(yǎng)基或生根培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)或生根培養(yǎng),采用L9(34)正交試驗設(shè)計和極差分析技術(shù),篩選最適增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法

⑴極差分析方法:運用美國北卡納州州立大學(xué)研制的SAS(Statistical Analysis System)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析系統(tǒng)處理相關(guān)數(shù)據(jù),其中:極差分析采用STAT模塊的ANOVA和GLM完成;

3 結(jié)果與分析

3.1 滅菌時間對外植體的影響

在超凈工作臺上,用0.1%HgCl溶液進行外植體表面滅菌5～7min,經(jīng)無菌水沖洗后,置無菌水中浸泡40～60 min。接種 3 d后,觀察結(jié)果(表1)顯示:滅菌不徹底的莖段出現(xiàn)污染及褐化現(xiàn)象,其中:經(jīng) 0.1%HgCl溶液表面滅菌5 min,外植體污染率及褐化率分別為55%、20%,污染嚴(yán)重;經(jīng)0.1%HgCl溶液表面滅菌6 min、7 min,外植體污染率較低(25%、15%),然而,表面滅菌7 min,外植體切口處褐化程度嚴(yán)重,褐化率60%。由此可見,經(jīng) 0.1%HgCl溶液表面滅菌 6 min效果理想,莖段污染率最低,褐化程度最輕。

表1 滅菌時間對外植體的影響

3.2 外植體腋芽萌發(fā)和生長誘導(dǎo)

在無菌條件下,將莖段接種到附加細(xì)胞分裂素、植物生長調(diào)節(jié)劑種類及濃度配比不同的基本培養(yǎng)基上,以誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)和生長。試驗設(shè)計6種腋芽萌發(fā)及叢芽再生培養(yǎng)基,分別為:IABA-MS+IAA 0.4mg/L+6-BA 0.8mg/L;IAKT-MS+IAA 0.4mg/L+KT 0.8mg/L;4DBA-MS+2,4-D 0.4mg/L+6-BA 0.8mg/L;4DKT-MS+2,4-D 0.4mg/L+KT 0.8mg/L;NABA-MS+NAA 0.4mg/L+6-BA 0.8 mg/L;NAKT-MS+NAA 0.4mg/L+KT 0.8 mg/L。試驗結(jié)果(表2)表明:植物生長調(diào)節(jié)劑濃度過低,莖段腋芽生長緩慢;濃度過高促使腋芽徒長,產(chǎn)生試管苗玻璃化現(xiàn)象。培養(yǎng)基內(nèi)生物調(diào)節(jié)劑種類及濃度配比直接影響腋芽萌發(fā)和生長,接種在附加0.8 mg/L生長素和0.4 mg/L細(xì)胞分裂素的基本培養(yǎng)基上,莖段腋芽表現(xiàn)良好,玻璃化程度極輕,其中:附加生長素IAA的效果明顯優(yōu)于2,4-D和NAA,平均成苗率分別為71%、56%、56%,平均苗高分別為 1.65cm、1.15cm、1.0cm;附加細(xì)胞分裂素6-BA的效果較KT理想,平均成苗率分別為66.7%、55.3%,平均苗高分別為1.40cm、1.13cm。綜合考慮細(xì)胞分裂素、植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度配比,確定MS+IAA 0.4mg/L+6-BA 0.8mg/L+蔗糖30mg/L+瓊脂 7.0mg/L為莖段腋芽萌發(fā)和生長的最適培養(yǎng)基。

表2 細(xì)胞分裂素、生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度配比對腋芽萌發(fā)及生長的效應(yīng)

3.3 增殖培養(yǎng)基優(yōu)選及不定芽增殖培養(yǎng)

將叢生芽單芽的芽尖分別接種于MS、1/2MS和3/4MS培養(yǎng)基上,培養(yǎng)中均分別附加3個濃度IAA、6-BA、蔗糖,以及瓊脂6.5 g/L。大量試驗結(jié)果說明:基本培養(yǎng)基、生長素、細(xì)胞分裂素種類和濃度配比直接影響叢芽增殖,以植物生長素影響效果最大,且6-BA影響效果大于IAA。若細(xì)胞分裂素(6-BA)濃度高于1.2 mg/L,即會產(chǎn)生玻璃化現(xiàn)象。采用L9(34)正交試驗設(shè)計和極差分析技術(shù)(表3)優(yōu)化選擇增殖培養(yǎng)基,由此可見,6-BA、IAA、基本培養(yǎng)基、蔗糖的極差(R)分別為2.4、2.0、0.68、0.62,對不定芽增殖影響效果由大至小順序:6-BA﹥IAA﹥基本培養(yǎng)基﹥蔗糖。K值由大至小順序:3/4MS﹥MS﹥1/2MS(基本培養(yǎng)基);0.5mg/L﹥0.3mg/L﹥0.7mg/L(IAA);1.0mg/L﹥0.8 mg/L﹥0.6 mg/L(6-BA);30 g/L﹥40g/L﹥20g/L(蔗糖),從而確定3/4MS+IAA 0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.5mg/L為不定芽最適增殖培養(yǎng)基。

表3 L9(34)正交試驗設(shè)計和級差分析結(jié)果

3.4 生根培養(yǎng)和練苗移栽

3.4.1 生根培養(yǎng)。以MS、1/2MS為基本培養(yǎng)基,附加0.2 mg/L、0.4mg/L、0.6 mg/L濃度生根調(diào)節(jié)劑(IBA),設(shè)計6種生根培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)接高度適宜的試管苗至生根培養(yǎng)基上,經(jīng)10 d暗培養(yǎng)后,轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)。測定結(jié)果顯示,基本培養(yǎng)基相同,附加IBA 0.4mg/L生根效果最佳,幼根數(shù)量及平均根長分別為8條/株(1/2MS)、6 條/株和 6.0 cm(1/2MS)、5.7 cm(MS);IBA濃度相同,植入1/2MS培養(yǎng)基,生根效果明顯優(yōu)于MS培養(yǎng)基,確定 1/2MS+IBA 1.4mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7 mg/L為最適生根培養(yǎng)基。

3.4.2 練苗移栽。在自然光條件下,掀開培養(yǎng)瓶的薄膜蓋,培養(yǎng)15 d后,取出發(fā)育良好的生根苗,洗凈根上附著的培養(yǎng)基,植入經(jīng)0.5%KMnO4消毒的混合基質(zhì)(河沙∶有機土∶腐熟雞糞=1∶3∶1)中,澆透水,噴施多菌靈消毒,并加強光照,改善通風(fēng)條件,翌年春季移入種質(zhì)資源保存圃。

4 結(jié)論

4.1 櫻桃李離體培養(yǎng)所需外植體必經(jīng)嚴(yán)格消毒滅菌,且滅菌時間直接影響培養(yǎng)效果,以0.1%HgCl溶液表面滅菌6 min最理想,莖段污染率最低,褐化程度最輕。

4.2 在基本培養(yǎng)基(MS)中附加適當(dāng)濃度細(xì)胞分裂素和植物生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)可有效誘導(dǎo)莖段離體再生,提高再生效率。櫻桃李莖段腋芽萌發(fā)最適培養(yǎng)基為MS+IAA 0.4mg/L+6-BA 0.8mg/L+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L,植入此培養(yǎng)基,莖段腋芽誘導(dǎo)率最高。

4.3 基本培養(yǎng)基、植物生長素和細(xì)胞分裂素種類及濃度配比直接影響叢芽增殖,植物生長素影響效果顯著,且6-BA影響效果大于IAA,通過正交試驗和極差分析,篩選出叢芽最適培養(yǎng)基,即:3/4MS+IAA 0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L+蔗糖30mg/L+瓊脂6.5g/L。

4.4 在基本培養(yǎng)基內(nèi)附加 IBA,生根效果最佳,且IBA濃度相同,植入1/2MS培養(yǎng)基,生根效果明顯優(yōu)于MS培養(yǎng)基,確定1/2MS+IBA1.4mg/L+瓊脂 7g/L+蔗糖30mg/L。

[1] 俞德浚.中國果樹分類學(xué)[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1979:58-60.

[2] 張加延,周恩.中國果樹志(李卷)[M].北京:中國林業(yè)出版社,1998:1-5.

[3] 陳正華.木本植物組織培養(yǎng)及應(yīng)用[M].北京:高等教育出版社,1986:303-310.

[4] 劉崇琪.新疆野生櫻桃李離體再生及其資源評價[D].泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2008:5-17.

[5] 蘭士波,田新華,李紅艷.歐洲甜櫻桃的組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)[J].中國園藝文摘,2010(10):27-28.