廣州市第一人民醫(yī)院1.放射科;2.普外科(廣東 廣州 510180)

徐宏剛1 徐 波2 陳 亮1 江新青1

高能聚焦超聲（high intensity focused ultrasound，HIFU）是利用超聲波組織穿透性和聚焦性等物理特性，將體外低能量超聲波束聚焦在體內(nèi)靶區(qū)，通過焦域處高能量超聲波產(chǎn)生的熱效應、空化效應及機械效應等，使局部產(chǎn)生高溫(≥65℃)，導致焦域區(qū)內(nèi)細胞產(chǎn)生不可逆死亡、蛋白質(zhì)變性和組織凝固性壞死，同時能破壞內(nèi)徑<2mm的腫瘤滋養(yǎng)血管，而位于聲通道上的組織及焦域周圍的組織不會受到損傷[1,2]。VX2瘤株起源于Shope病毒誘發(fā)的兔乳頭狀瘤衍生的鱗癌，經(jīng)過72次移植傳代后正式立株。磁共振灌注加權成像（perfusion-weighted imaging，PWI）是近年來發(fā)展起來的磁共振新技術，能定量分析組織微循環(huán)血流灌注變化，反映腫瘤血流灌注情況，在檢出、監(jiān)測腫瘤和評價治療效果等方面有重要價值。

材料與方法

1.1 建立動物模型 新西蘭大白兔15只，雌雄不限，體重1.5-2.5kg，由廣東省醫(yī)學動物中心提供。VX2瘤株購于廣西醫(yī)科大學。將瘤株接種于兔腹股溝區(qū)皮下或肌肉間，使之成瘤并以之傳代。3-4周后將兔全麻后無菌條件下剝離腫瘤，切開瘤體取靠近包膜的灰白色魚肉樣組織置于盛有生理鹽水(100ml含青霉素4萬u)中，剔除壞死組織及纖維組織，將瘤組織剪碎至約1mm3左右的小塊備用。于兔耳緣靜脈注入速眠新(0.2ml/kg)全麻后無菌條件下逐層開腹，暴露肝臟，以眼科鑷于肝左葉較厚處刺破肝組織并形成口小(3-5mm)底大(5-8mm)的“燒瓶”樣竇道,將2-3塊剪碎的瘤株植入其中，并以明膠海綿碎塊埋塞竇口。確切止血后回納肝臟，逐層關腹，注入青霉素8萬u/kg。術后三天常規(guī)注射青霉素和慶大霉素各4萬u/kg。2周后待腫瘤直徑≥1cm時麻醉后送入HIFU治療中心，行HIFU治療，單次治療，治療后送回動物中心飼養(yǎng)，于治療后14天再次行MR檢查，檢查完畢處死動物，取病理標本迅速固定于中性甲醛溶液中，石臘包埋后作CD34病理檢測。

圖1 T2WI壓脂瘤體呈相對稍高信號，信號較均勻，邊界尚清，肝內(nèi)未見轉(zhuǎn)移灶。圖2、3 HIFU治療后的原始灌注圖及rHVB圖。圖4 治療后瘤體中央呈灰紅色或灰白色，腫瘤細胞壞死明顯，血管減少。圖5、6 左圖為治療前CD34染色圖片，可見微血管生成明顯，視野內(nèi)血管腔多見；右圖為治療后CD34圖，可見治療區(qū)為大片無結構壞死區(qū)，無微血管生成。圖7 治療后治療區(qū)與非治療區(qū)的SRSmax值與MVD計數(shù)比較。

1.2 掃描方法 速眠新0.2ml/kg深度麻醉兔后，使用自制腹帶加壓固定，采用Philips 1.5T磁共振掃描儀，8通道膝關節(jié)掃描線圈，采用呼吸門控行常規(guī)T1W、T2W（橫斷、冠狀、矢狀）掃描后，行PWI掃描，PWI掃描采用EPI-SE序列、SENSE技術。掃描參數(shù)：TR2000ms，TE80ms，層厚2mm，間距0.3mm，NSA 2，視野(FOV)150mm，矩陣256×256。對比劑為釓雙胺注射液(Gd-DTPABMA)，劑量0.3mmol/kg，采用高壓注射器注射，掃描3個相位后注射對比劑。每只兔掃描獲得原始灌注圖數(shù)量920-1080張不等。

1.3 影像學分析 所有的灌注原始圖像均傳送至工作站用其配套軟件進行處理，分別測量治療后不同感興趣區(qū)（ROI）信號強度，以ROI內(nèi)的信號強度平均值為基礎構建血流灌注的信號強度-時間曲線，分析ROI在治療后MR信號變化，計算最大信號下降斜率(maximal signal reduction slope， SRSmax)，并利用相關功能軟件繪制相對肝血容量(relative hepatic blood volume，rHBV)圖。

ROI測量方法：在腫瘤治療區(qū)和瘤旁肝實質(zhì)各畫3個ROI(取平均值)，注意ROI應盡可能大包括欲測區(qū)，各相關數(shù)據(jù)直接從畫圖軟件右上角圖形視圖中獲取[3]。SRSmax計算公式為：SRSmax=(SIpre-SIp)/TTP，SIpre為PWI圖像穩(wěn)定后至信號下降前的ROI信號強度的平均值，SIp為灌注峰值時刻的ROI信號強度值，TTP為達峰時間(ROI信號強度下降的開始時刻到降為峰值時刻之間的時間寬度)。

1.4 病理學檢測 腫瘤內(nèi)MVD檢測采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(streptavidinperosida，SP)三步法，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色。所用一抗為抗CD34(武漢博士德公司，工作濃度1：50)。采用PBS液代替一抗作陰性對照，全部為陰性；采用已知MVD陽性的皮膚血管肉瘤標本取代VX2瘤組織作為陽性對照，全部為陽性。MVD計數(shù)參照文獻[4,5]方法進行，先在低倍鏡(×40)下全面觀察切片，選出血管密度區(qū)(即“熱點”)，后在高倍鏡(×400)下分別取3個視野計數(shù)微血管，以染成棕色血管內(nèi)皮或內(nèi)皮細胞束作為1條血管數(shù)，血管腔和腔內(nèi)紅細胞不作為計數(shù)單位，與抗體起反應的巨噬細胞和漿細胞等在鏡下根據(jù)形態(tài)學差異予以排除，以3個高倍鏡視野的微血管平均數(shù)作為該切片MVD值。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計分析，不同ROI的SRSmax的比較采用單因素方差分析、非參數(shù)檢驗和t檢驗，判斷相關性采用Pearson分析。P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

2.1 VX2瘤兔建模與生存情況15只VX2瘤兔均成功建模，術后14天掃描，發(fā)現(xiàn)腫瘤共18個，其中12只1個病灶，3只2個病灶，瘤體最大徑分別為（1.27±0.15）cm，瘤體平掃T1W為稍低信號，T2W為稍高信號，信號較均勻，部分邊界欠清楚。病灶局限于肝臟內(nèi)，未見轉(zhuǎn)移（圖1）。治療后腫瘤體積均較前有所增大，治療后14天瘤體最大徑約（1.95±0.48）cm ，T2W信號不均勻，可見高、低混雜信號。2只荷瘤兔發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶，腹腔種植、腹水可見。

2.2 治療后兔VX2肝癌的PWI及MVD變化 治療后rHVB圖顯示VX2瘤治療區(qū)（即腫瘤實質(zhì)區(qū)）灌注程度降低，其SRSmax值較治療前明顯下降；非治療區(qū)（即瘤旁肝實質(zhì)）血流灌注未見明顯變化，其SRSmax值治療前后無明顯差異（圖2、3）。

2.3 病理改變 治療區(qū)肉眼觀察腫瘤血管減少，鏡下見毛細血管內(nèi)皮細胞退化，細胞壞死明顯，瘤周見水腫和炎性反應。非治療區(qū)大體肉眼觀察見瘤體呈灰白色魚肉樣，表面血管增多增粗，鏡下腫瘤邊界不清，核大、分裂像多見，間質(zhì)少，微血管豐富（圖4）。

病理檢測顯示CD34主要表達于兔肝VX2瘤血管內(nèi)皮細胞,呈棕黃色、淺褐色；腫瘤區(qū)內(nèi)巨噬細胞、漿細胞及腫瘤和瘤旁肝實質(zhì)匯管區(qū)內(nèi)少量血管亦偶有非特異性染色（圖5、6）。治療后治療區(qū)CD34低表達，MVD計數(shù)明顯低于非治療區(qū)（圖7）。

2.4 統(tǒng)計學結果 治療前瘤體實質(zhì)區(qū)SRSmax值明顯高于瘤旁肝實質(zhì)，治療后SRSmax值改變明顯，低于瘤旁肝實質(zhì)（表1）；治療后不同ROI的SRSmax與MVD作方差齊性檢驗無統(tǒng)計學差異，進一步作直線相關分析，治療區(qū)SRSmax與MVD呈正相關（r=0.574，P=0.004）（表2）。

討 論

PWI可清楚顯示腫瘤微循環(huán)血流狀況，主要采用動態(tài)團注示蹤(dynamic bolus tracking,DBT)法，其基本原理來源于核醫(yī)學中的示蹤劑稀釋原理及中央容積定理，通過團注對比劑后，采用超快速成像技術，檢測對比劑首過組織時引起的局部信號強度改變，計算其T1、T2或重T2(T2*)弛豫率的變化，再通過適當數(shù)學模型變換得到組織血流灌注的定量信息，用于了解其血液動力學特征，評價微循環(huán)狀態(tài)[6,7]。

腫瘤血管生成是實體性腫瘤生長和轉(zhuǎn)移基礎[8]。肝癌具有很強的誘導血管生成能力,其血管生成程度與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及預后密切相關,故本研究選擇ROI內(nèi)MVD計數(shù)作為腫瘤血管生成、破壞的程度和范圍標記物進行病理檢測的結果認為較為可靠[8,9]，本實驗證明，無論治療前、后，不同ROI的灌注程度及范圍與MVD計數(shù)結果一致。治療前兔肝移植瘤治療區(qū)SRSmax明顯增高，且高于非治療區(qū)，說明腫瘤組織有較多的新生微細血管，血流灌注程度非常高，這也是腫瘤生長、轉(zhuǎn)移的前提。HIFU治療后治療區(qū)SRSmax明顯下降，其差異有統(tǒng)計學意義，同時病理檢測顯示CD34呈低表達，MVD計數(shù)較治療前明顯降低，與PWI表現(xiàn)一致，兩者呈正相關，這說明HIFU可以有效的破壞腫瘤的微血管，減少瘤體微血管形成，破壞腫瘤血管生成，從而減少腫瘤血供，達到滅活腫瘤的目的。

表1 兔肝VX2種植瘤治療組HIFU治療前、后SRSmax比較

綜上，PWI作為一種無創(chuàng)性功能成像方法，在臟器功能研究、病灶檢出、腫瘤性質(zhì)、預測腫瘤療效及判斷預后等方面有巨大潛力，同時病理、影像學對照對于判斷腫瘤組織來源、血供情況等非常重要，SRSmax結合MVD可能作為評價腫瘤微血管生成、破壞的指標，但如何應用于臨床仍有待進一步研究。

1.Yang R,Reilly CR,Rescorla FJ,et al.High intensity focused ultrasound in the treatment of experimental liver cancer[J].Arch Surg,1991,126(7):1002-1009.

2.黃海玉,劉小樂,王冰,等.高強度聚焦超聲治療子宮肌瘤的研究進展. [J] 罕少疾病雜志, 2009, 16(4):23-25.

3.江新青，陳亮，魏新華，等. 兔VX2肝癌高能聚焦超聲治療后MR灌注加權成像的研究[J]. 中華放射學雜志, 2009,43(2): 196-200.

4.Weidner N. Current pathologic methods for measuring intratumoral microvessel density within breast carcinoma and other solid tumors[J]. BreastCancerResTreat, 1995, 36(2): 169-180.

5.Vermeulun PB,Verhoeven D, Fierens H, et al. Microvesselquantification in primary colorectal carcinoma: an immunohistochemical study[J]. Br JCancer, 1995, 71(2): 340-343.

6.Reinig JW,Dwyer AF,Miller DL,et al.Liver metastases detection:comparative sensitivities of MR imaging and CT scanning[J].Radiology 2003;162(1):43-47.

7.Heiken JP,Weyman PJ,Lee JKT,et al.Detection of focal hepatic masses:Prospective evaluation with CT,delayed CT, CTAP,and MR imaging[J].Radiology 1999;171:47-51.

8.姜慧杰，徐克，張慧博，等. 多層螺旋CT灌注成像活體評價肝VX2移植瘤新生血管生成[J].中國醫(yī)學影像技術,2007,23(7):967-970.

9.Ferrari FS,Megliola A,Scorzelli A,et al.Treatment of HCC through radiofrequency904學雜志ablation and laser ablation.Comparison of techniques and long-term results[J].Radiol Med (Torino).2007,12(3):377-393.