朱政斌

(湖南理工學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院, 湖南 岳陽(yáng) 414006)

胸腺肽α1(Tα1)是動(dòng)物胸腺素組分5(TF5)的主要活性組分, 是其中活性最強(qiáng)的組分之一[1]. 它是一種新型免疫調(diào)節(jié)因子, 通過誘導(dǎo)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟淋巴細(xì)胞, 刺激淋巴系統(tǒng), 提高機(jī)體免疫功能. 臨床上應(yīng)用胸腺肽α1提高T細(xì)胞的免疫功能[2], 治療病毒性肝炎和延緩某些老年病的發(fā)生與發(fā)展. 胸腺肽α1還有抗感染、抗病毒和抗腫瘤的功效, 尤其對(duì)癌癥的免疫性治療也具有一定的作用[3～8]. 組織提取胸腺肽α1受材料來源限制, 工作量大、成本高, 難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn). 目前國(guó)外已將其肽合成產(chǎn)品應(yīng)用于臨床, 對(duì)腫瘤、乙肝、丙肝及免疫缺陷等的治療研究已取得了良好的效果. 但采用化學(xué)合成的方法成本較高, 并且存在消旋問題. 采用基因工程表達(dá)的方法是一種可行的思路, 目前國(guó)內(nèi)外在表達(dá)方法的研究主要集中在融合表達(dá)[9]或者串聯(lián)表達(dá)[10], 而且大多沒有考慮胸腺肽α1的N端乙?；膯栴}. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院方宏清[11]等通過構(gòu)建胸腺肽α1-內(nèi)含肽表達(dá)載體和Rim J表達(dá)載體, 將兩載體共轉(zhuǎn)BL21, 從而解決了N端乙酰化問題, 但該方法在生產(chǎn)過程中會(huì)產(chǎn)生C端部分修飾問題, 導(dǎo)致產(chǎn)率下降. 而Roman S[12]等則通過表達(dá)與化學(xué)方法?；嘟Y(jié)合實(shí)現(xiàn)了胸腺肽α1的生產(chǎn).

彈性蛋白樣多肽(ELP, elastin-like polypeptide)是一種對(duì)環(huán)境溫度敏感的人造基因工程蛋白聚合物[13],其結(jié)構(gòu)主要由五肽重復(fù)序列單元構(gòu)成, 源自于彈性蛋白的疏水區(qū)域. ELP具有一個(gè)相變溫度, 當(dāng)環(huán)境溫度低于相變溫度時(shí), ELP高度可溶, 而當(dāng)環(huán)境溫度高于相變溫度時(shí), ELP聚合沉淀. ELP的這一特性在生物醫(yī)學(xué)材料, 抗腫瘤藥物的靶向運(yùn)輸?shù)确矫骟w現(xiàn)了較好的優(yōu)勢(shì). David W Wood[14,15]工作組運(yùn)用ELP蛋白的特性以及內(nèi)含肽的酶切活性, 建立了一種可用于蛋白生產(chǎn)的方法, 該方法可以獲得不含任何序列標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白, 并且不需要色譜進(jìn)行分離純化, 大大降低了蛋白生產(chǎn)過程中的生產(chǎn)成本.

考慮到方宏清等的方法在生產(chǎn)過程中能夠?qū)崿F(xiàn)胸腺肽α1的N端乙酰化, David W Wood等的方法能實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)無色譜分離純化, 本文在方宏清和David W Wood等工作的基礎(chǔ)上, 通過構(gòu)建Tα1-Gly-ELP蛋白表達(dá)載體和Rim J蛋白表達(dá)載體, 共轉(zhuǎn)BL21菌株, 建立了一種無需色譜和親和純化的胸腺肽α1的生產(chǎn)方法,實(shí)現(xiàn)了胸腺肽α1的低成本生產(chǎn).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌種與試劑

E.coli DH5α, BL21, Top10等菌種為本室自行保持, pACYCDuet1, pET41a(+)為本室自行保存, 限制性內(nèi)切酶為NEB公司產(chǎn)品, 生化試劑為Sigma公司產(chǎn)品.

1.1.2 基因合成與引物設(shè)計(jì)

委托上海生工生物工程有限公司合成基因和引物序列如下:

Tα1-Gly序列:

ELP序列:

Rim J引物:

RimJ-F: GGAATTC CATATG TTT GGC TAT CGC AGT AAC

RimJ-R: CGG GGTACC TTA GCG GCC GGG CGT CCA

1.2 方法

1.2.1 載體構(gòu)建

Tα1-Gly-(ELP)n-pET41 a(+)載體構(gòu)建. 將合成的ELP人工基因進(jìn)行退火, 載體和ELP人工基因進(jìn)行EcoRI和HindIII雙酶切, 構(gòu)建ELP-pET41 a(+), 抽提質(zhì)粒部分進(jìn)行PflMI和BglI雙酶切, 部分PflMI單酶切,雙酶切收集的小片段插入單酶切線性化的質(zhì)粒, 構(gòu)建成(ELP)2-pET41 a(+), 如此重復(fù)構(gòu)建(ELP)n-pET41 a(+); 將人工合成的Tα1-Gly序列進(jìn)行退火, 并與構(gòu)建的(ELP)n-pET41 a(+)進(jìn)行NdeI和EcoRI雙酶切, 連接反應(yīng)構(gòu)建Tα1-Gly-ELP[V5-10]-pET41 a(+), Tα1-Gly-ELP[V5-20]-pET41 a(+), Tα1-Gly-ELP[V5-30]-pET41 a(+), Tα1-Gly-ELP[V5-40]-pET41 a(+), Tα1-Gly-ELP[V5-50]-pET41 a(+), Tα1-Gly-ELP[V5-60]-pET41 a(+),Tα1-Gly-ELP[V5-70]-pET41 a(+)表達(dá)載體, 轉(zhuǎn)入BL21菌株. RimJ-pACYCDuet載體構(gòu)建見文[11], 將構(gòu)建的RimJ-pACYCDuet轉(zhuǎn)入BL21.

1.2.2 目的基因的表達(dá)

將菌種接種到普通LB培養(yǎng)基中, 30℃, 210rpm培養(yǎng)約10h, 收集菌體作為種子, 將種子接種至200mL自誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基中, 37℃, 210rpm培養(yǎng)約12h后收集菌體, 將收集的菌體用緩沖液重懸, 冰浴條件下超聲破菌, 低溫離心收集上清, 將收集上清加熱至50℃, 離心收集沉淀, 收集沉淀用預(yù)冷的緩沖液溶解后離心收集上清, 收集上清加熱至50℃, 離心收集沉淀, 如此反復(fù)3～4次.

1.2.3 目標(biāo)蛋白羥胺裂解

目標(biāo)蛋白羥胺裂解方法根據(jù)文獻(xiàn)[6]進(jìn)行改進(jìn), 采用組氨酸緩沖液, pH9.0, 40℃裂解6h, 裂解完畢加熱至50℃后離心收集上清, 將收集的上清進(jìn)行色譜分析和質(zhì)譜檢測(cè).

2 結(jié)果

2.1 載體的構(gòu)建

將人工合成的ELP基因退火并進(jìn)行EcoRI和HindIII雙酶切, 回收片段, 將pET41 a(+)進(jìn)行EcoRI和HindIII雙酶切, 回收線性化載體片段, 進(jìn)行連接構(gòu)建ELP-pET41 a(+), 將ELP-pET41 a(+)載體進(jìn)行PflMI和BglI雙酶切, 回收小片段, 將ELP-pET41 a(+)載體進(jìn)行PflMI單酶切并脫磷, 回收線性化載體, 進(jìn)行連接,構(gòu)建(ELP)2-pET41 a(+), 如圖1所示構(gòu)建(ELP)n-pET41 a(+), 將構(gòu)建的一系列載體進(jìn)行PCR檢測(cè), 用1.5%的瓊脂糖膠進(jìn)行檢測(cè), 結(jié)果如圖2所示(其中l(wèi)ane1: ELP[V5-10]; lane2: ELP[V5-20]; lane3: ELP[V5-30];lane4: ELP[V5-40]; lane5: ELP[V5-50]; lane6: ELP[V5-60]; lane7: ELP[V5-70]). 將上述構(gòu)建的一系列載體進(jìn)行NdeI和EcoRI雙酶切, 切除載體的融合標(biāo)簽, 將人工合成的Tα1基因進(jìn)行退火并進(jìn)行NdeI和EcoRI雙酶切, 回收酶切片段并與線性化載體進(jìn)行連接構(gòu)建Tα1-Gly-(ELP)n-pET41 a(+). 抽提大腸桿菌DNA, PCR擴(kuò)增RimJ基因, PCR產(chǎn)物進(jìn)行NdeI和KpnI雙酶切, 同時(shí)將pACYCDuet載體進(jìn)行NdeI和KpnI雙酶切, 回收線性化載體與RimJ基因進(jìn)行連接構(gòu)建RimJ-pACYCDuet載體并測(cè)序證實(shí)載體構(gòu)建正確, 將RimJ-pACYCDuet載體和Tα1-Gly-(ELP)n-pET41 a(+)載體共轉(zhuǎn)BL21, 篩選陽(yáng)性克隆.

圖1 載體構(gòu)建示意圖

圖2 構(gòu)建載體PCR檢測(cè)

圖3 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

2.2 重組融合蛋白表達(dá)

在相同條件下表達(dá)Tα1-Gly-ELP[V5-10], Tα1-Gly-ELP[V5-20], Tα1-Gly-ELP[V5-30], Tα1-Gly-ELP[V5-40], Tα1-Gly-ELP[V5-50], Tα1-Gly-ELP[V5-60], Tα1-Gly-ELP[V5-70], 對(duì)這一系列表達(dá)載體表達(dá)蛋白進(jìn)行純化, 收集融合蛋白, 測(cè)定蛋白量, 結(jié)果如圖3B所示. (圖3A為蛋白誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果: lane1: Tα1-Gly-ELP[V5-40]誘導(dǎo)表達(dá); lane2: Gly-ELP[V5-40]非誘導(dǎo)表達(dá). 圖3B為蛋白誘導(dǎo)表達(dá)純化結(jié)果: lane1:Tα1-Gly-ELP[V5-10]; lane2: Tα1-Gly-ELP[V5-20]; lane3: Tα1-Gly-ELP[V5-30]; lane4: Tα1-Gly-ELP[V5-40];lane5 Tα1-Gly-ELP[V5-50]; lane6 Tα1-Gly-ELP[V5-60]; lane7: Tα1-Gly-ELP[V5-70]). 通過計(jì)算Tα1的含量,表明Tα1-Gly-ELP[V5-40]表達(dá)獲得的Tα1含量最高. Tα1-Gly-ELP[V5-40]表達(dá)可以獲得240mg/L的融合蛋白表達(dá)量.

2.3 目的蛋白羥胺裂解

文[16]顯示羥胺裂解可能導(dǎo)致谷氨酰胺和天冬酰胺的酰胺被修飾, 采用組氨酸緩沖液可以有效抑制酰胺修飾. 本試驗(yàn)通過采用組氨酸緩沖液進(jìn)行羥胺裂解, 裂解完成后升溫至50℃, 離心收集上清, 上清液進(jìn)行反相高效液相色譜分析與質(zhì)譜檢測(cè), 結(jié)果如圖4、5所示. 從圖4可知, 上清液基本只含目的肽, 從圖5可知, 目的肽為分子量3108的多肽, 與預(yù)期一致. 1L發(fā)酵液經(jīng)過細(xì)菌破碎, 變溫沉淀, 羥胺裂解, 變溫沉淀, 上清液脫鹽等步驟獲得目標(biāo)多肽29.5mg. 采用羧肽酶Y結(jié)合MALDI-TOF MS技術(shù)測(cè)定純化多肽的羧基端氨基酸序列, 測(cè)定了12個(gè)氨基酸殘基, 氨基酸序列為-K-E-K-K-E-V-V-E-E-A-E-N, 結(jié)果如圖6所示,與預(yù)期結(jié)果一致.

圖4 裂解上清的RP-HPLC圖

圖5 胸腺肽α1的質(zhì)譜分析

圖6 羧肽酶Y結(jié)合質(zhì)譜對(duì)胸腺肽α1的C端測(cè)序圖

3 討論

Tα1作為一種免疫增強(qiáng)劑, 在臨床上應(yīng)用廣泛. 目前市場(chǎng)上提供的Tα1產(chǎn)品無論是進(jìn)口產(chǎn)品還是國(guó)產(chǎn)產(chǎn)品均是通過化學(xué)合成, 價(jià)格昂貴. 國(guó)內(nèi)外對(duì)用基因工程方法生產(chǎn)Tα1進(jìn)行了大量的研究. Tα1是小肽, 采用基因工程方法生產(chǎn)小肽主要采用串聯(lián)表達(dá)方法或者融合表達(dá)方法, 采用串聯(lián)表達(dá)方法主要問題是表達(dá)獲得串聯(lián)蛋白后的處理較困難, 而采用融合蛋白表達(dá)方法的主要問題是目標(biāo)蛋白在融合蛋白中的含量較低. 由于第一種方法不能生產(chǎn)N端乙酰化肽, 所以只能采用第二種方法.

在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí), 我們選擇了人工合成基因, 選擇大腸桿菌偏愛的密碼子, 以提高表達(dá)效率. 由于要進(jìn)行N端乙?；揎? 所以將Tα1構(gòu)建在N端. ELP融合蛋白主要是利用了ELP在較低溫度時(shí)為可溶狀態(tài),在較高溫度時(shí)形成納米的特點(diǎn), 這樣可以很簡(jiǎn)便地把融合蛋白從蛋白混合物中分離純化出來而不需要使用親和純化. 從圖4反相HPLC分析圖譜結(jié)果可知, 變溫沉淀上清液中基本只含目標(biāo)產(chǎn)物, 說明基本不需要使用色譜系統(tǒng)進(jìn)行純化, 是一種低成本的生產(chǎn)蛋白的方法. 運(yùn)用基因工程表達(dá)蛋白, 其主要生產(chǎn)成本在蛋白純化, 所以選擇ELP融合蛋白生產(chǎn)Tα1是一種可行的策略.

采用羥胺裂解則由于羥胺本身毒性比較低, 裂解效率較高, 通過控制反應(yīng)條件可以完全克服副反應(yīng),而且裂解時(shí)間較酶解時(shí)間大大縮短, 并且成本遠(yuǎn)比酶成本低. 本方法也沒有采用文[15]方法, 該文采用內(nèi)肽酶的方法, 但本實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)的是小肽, 如果增加一個(gè)內(nèi)肽酶, 則小肽在融合蛋白質(zhì)中所占的比重更小, 不利于提高產(chǎn)量, 而且C端會(huì)出現(xiàn)部分修飾現(xiàn)象. 通過實(shí)驗(yàn), 我們發(fā)現(xiàn)采用本方法生產(chǎn)Tα1, 1L培養(yǎng)基可以生產(chǎn)純度為98%的目標(biāo)多肽29.5mg.

采用ELP融合蛋白方法生產(chǎn)Tα1, 表達(dá)量較高, 并且下游純化簡(jiǎn)便易行, 為基因工程方法大規(guī)模生產(chǎn)Tα1打下了基礎(chǔ).

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