朱 婕，洪俊麗，秦民堅

(中國藥科大學(xué)中藥資源學(xué)教研室，教育部現(xiàn)代中藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京211198)

紫花地丁為堇菜科植物紫花地丁(Viola yedoensis Makino)的干燥全草，性寒，味苦、辛，具有清熱解毒，涼血消腫之功效。用于疔瘡腫毒，癰疽發(fā)背，丹毒，毒蛇咬傷［1］。在我國除了青海、西藏外分布廣泛。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，紫花地丁具有抗菌，抗炎，抗病毒，抗氧化等藥理活性［2－4］，并具有免疫增強(qiáng)功能和降脂作用［5－6］。

自古以來紫花地丁來源混亂，各地習(xí)用藥材種類繁多，紫花地丁同名異物現(xiàn)象嚴(yán)重，而且市面上紫花地丁藥材質(zhì)量差異較大。紫花地丁藥材及其混淆品的HPLC指紋圖譜研究已有報道［7］，并已有高效液相色譜法測定紫花地丁中某一成分的研究報道。但目前的指紋圖譜分析未對主要成分峰進(jìn)行歸屬，且僅測定藥材中單一成分的含量，無法全面反應(yīng)藥材的內(nèi)在質(zhì)量。為了確保紫花地丁用藥安全，減少品種亂用現(xiàn)象，控制藥材質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)利用HPLC法建立了12批紫花地丁商品藥材的指紋圖譜，指認(rèn)了4個特征峰并建立其含量同時測定方法，比較它們在藥材中的含量，反映藥材內(nèi)在質(zhì)量差異。以期為紫花地丁整體化學(xué)成分進(jìn)行質(zhì)量控制提供有效方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Aglient 1100高效液相色譜儀(四元泵、柱溫箱、自動脫氣機(jī)，單波長紫外檢測器、Aglient 1100色譜工作站);中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版;MP120－1型電子分析天平(上海第二天平儀器廠)。

1.2 試劑

色譜甲醇(江蘇淮陰漢邦科技有限公司)，實(shí)驗(yàn)用水為樂百氏純凈水(廣州百氏食品飲料有限公司)，其余所用試劑皆為分析純。

1.3 樣品及對照品

紫花地丁分別購于江蘇、河北、湖北、安徽、河南等地藥材市場或藥店，由中國藥科大學(xué)秦民堅教授鑒定為堇菜科植物紫花地丁(Viola yedoensis Makino)的干燥全草。藥材粉碎，過60目篩，備用。菊苣苷、七葉內(nèi)酯、早開堇菜苷均為本實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)1H－NMR、12C－NMR和MS鑒定，并經(jīng)HPLC檢測，純度均高于98%，東莨菪素(批號:110768－200504)購自中國藥品生物制品檢定所。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Aglient C18(4.6 mm × 150 mm，5 μm)。流動相:0.5%醋酸水溶液(A)－甲醇(B)。洗脫梯度:0～5 min，5% ～19%B，5 ～40 min，19% ～21%B，40～58 min，21% ～30%B，58 ～75 min，30% ～70%B，75 ～100 min，70% ～95%B。柱溫:30°C，流速:1.0 mL/min，檢測波長:353 nm，進(jìn)樣量20 μL。

2.2 對照品溶液的制備

分別稱取菊苣苷、七葉內(nèi)酯、東莨菪素、早開堇菜苷適量，加甲醇分別配制成濃度分別為0.028 8 mg/mL，0.045 mg/mL，0.009 5 mg/mL，0.005 4 mg/mL的對照品溶液，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，備用。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取紫花地丁藥材干燥細(xì)粉1.0 g，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇15 mL，熱回流提取1 h，放冷至室溫，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，濾液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察

分別稱取菊苣苷、七葉內(nèi)酯、東莨菪素、早開堇菜苷對照品適量，加甲醇配置成一系列對照品溶液，按色譜條件分別進(jìn)行HPLC檢測，以溶液濃度X(mg/mL)為橫坐標(biāo)，積分峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，菊苣苷、七葉內(nèi)酯、東莨菪素、早開堇菜苷質(zhì)量濃度分別在0.012～1.17 mg/mL，0.002 0 ～ 0.039 mg/mL，0.001 0 ～ 0.20 mg/mL，0.004 9～0.034 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果見表1。

表1 菊苣苷、七葉內(nèi)酯、東莨菪素和早開堇菜苷的線性關(guān)系

2.4.2 菊苣苷、七葉內(nèi)酯、東莨菪素、早開堇菜苷的含量測定

根據(jù)“2.1”項下方法對12個批次的供試品進(jìn)行測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出各樣品在供試品中的含量，結(jié)果見表2。

表2 菊苣苷、七葉內(nèi)酯、東莨菪素和早開堇菜苷的含量/%

2.4.3 精密度實(shí)驗(yàn)

稱取紫花地丁藥材(S1)，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，測得各共有峰相對保留時間和相對峰面積 RSD分別為1.56% ～2.47%和1.33% ～2.51%，符合指紋圖譜色譜條件技術(shù)要求。

2.4.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

稱取紫花地丁粉末(S1)，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別在 0，4，8，12，16，20 和24h 分別進(jìn)行檢測，測得各共有峰相對保留時間和相對峰面積 RSD 分別為 1.84% ～2.49% 和 2.78% ～2.84%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，符合指紋圖譜色譜條件技術(shù)要求。

2.4.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

稱取紫花地丁粉末(S1)6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，測得各共有峰相對保留時間和相對峰面積 RSD分別為1.89% ～2.74%和1.69%～2.11%，表明方法重復(fù)性良好，符合指紋圖譜色譜條件技術(shù)要求。

2.4.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

稱取已知含量的紫花地丁粉末6份(S1)，加入1 mL對照品溶液，按選定的色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)測得菊苣苷、秦皮乙素、東莨菪素、早開堇菜的加樣回收率分別為 96.01% ～101.77%，95.37% ～104.59%，95.53% ～ 104.42% 和 97.48% ～104.65%，RSD 值分別為 1.14%、1.60%、2.23%和 2.61%。

2.5指紋圖譜的分析與評價

2.5.1 指紋圖譜的建立及共有峰的的標(biāo)定

取紫花地丁藥材，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，將對照品和12個供試品溶液按選定的色譜條件分別進(jìn)樣，進(jìn)行測定分析，得到樣品HPLC色譜圖。以批號8參照圖譜，生成對照圖譜，見圖1。

圖1 12批紫花地丁樣品對照圖譜

經(jīng)對照品定性，鑒定出1號色譜峰為菊苣苷，6號色譜峰為七葉內(nèi)酯，9號色譜峰為東莨菪素，13號色譜峰為早開堇菜苷，見圖2。

圖2 菊苣苷、七葉內(nèi)酯、東莨菪素和早開堇菜苷對照圖譜

利用中國藥典委員會頒布的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2004版A)處理圖譜，確定18個共有峰。其中七葉內(nèi)酯峰(19.37 min)峰面積最大，與相鄰峰分離度較好，因此選定七葉內(nèi)酯為參比峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果見圖3。

圖3 12批紫花地丁藥材對照指紋圖譜共模式

2.5.2 相似度評價

將12批紫花地丁藥材采用用中國藥典委員會頒布的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2004版A)，使用中位數(shù)法對所得的HPLC指紋圖譜全譜進(jìn)行相似度計算，并對共有峰的相對峰面積進(jìn)行計算，結(jié)果見表2。

表2 紫花地丁藥材相似度結(jié)果

3 討論

由于藥材可能受到采收期、土壤、氣候等環(huán)境因素及采收加工、運(yùn)輸?shù)戎T多因素的影響，使內(nèi)部的化學(xué)成分有所差異，從而影響藥材質(zhì)量。本文對12個批次的紫花地丁商品藥材進(jìn)行了HPLC分析，選擇了穩(wěn)定性好，吸收強(qiáng)的18個色譜峰作為共有峰。結(jié)果顯示這12批的紫花地丁藥材相似度大于0.931，共有峰占總出峰數(shù)的比例大于90.98%。證明這12批藥材無顯著性差異，所選擇的共有峰可以作為紫花地丁藥材指紋圖譜的特征峰，可以作為鑒別紫花地丁藥材真?zhèn)蔚囊罁?jù)。

單一的活性成分或指標(biāo)成分難以有效地評價中藥的真?zhèn)蝺?yōu)劣。因此本次試驗(yàn)經(jīng)過與對照品比對，以菊苣苷、七葉內(nèi)酯、東莨菪素、早開堇菜苷作為指標(biāo)性成分，比較了上述成分在商品藥材中的含量差異。定量的結(jié)果表明，菊苣苷、秦皮乙素、東莨菪素、早開堇菜苷含量分別為 0.016% ～3.006 mg/g，14.438% ～14.912 mg/g，0.183% ～0.524 mg/g 和0.221% ～0.513 mg/g。因此可以考慮將這4種成分的含量作為判定藥材質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)。

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部［S］:北京:人民衛(wèi)生出版社，2005:317.

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