楊德智，徐維盛，張麗，楊世穎，呂揚(yáng)

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京市 100050）

優(yōu)化《中國藥典》羅紅霉素HPLC含量測定方法研究Δ

楊德智＊，徐維盛，張麗，楊世穎，呂揚(yáng)#

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京市 100050）

目的：優(yōu)化高效液相色譜法檢測羅紅霉素含量的最佳流動相條件，改善現(xiàn)行方法中主峰拖尾現(xiàn)象。方法：選取流動相中緩沖液濃度、pH值、三乙胺含量、乙腈用量為影響因素，以羅紅霉素色譜峰拖尾因子（T1）、保留時(shí)間（tR）、半峰寬（W1/2）及理論板數(shù)（N）為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)優(yōu)化含量測定方法并與2010年版《中國藥典》含量測定方法比較。結(jié)果：優(yōu)化后含量測定方法：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相：0.067mol·L－1磷酸二氫銨溶液（三乙胺含量0.3%，調(diào)pH值至7.5）-乙腈（60∶40），檢測波長：205nm，柱溫：30℃，流速：1.0mL·min－1，進(jìn)樣量：20μL。優(yōu)化后方法與藥典方法的比較結(jié)果：T1為1.2、1.9；tR為14.133、12.383min；W1/2為0.400、0.533；N為6916、2987。結(jié)論：優(yōu)化后方法較2010年版《中國藥典》方法提高了柱效，延長了保留時(shí)間，較好地改善了色譜峰拖尾嚴(yán)重的狀況。

正交試驗(yàn)；高效液相色譜法；羅紅霉素；優(yōu)化；流動相；含量測定；《中國藥典》

《歐洲藥典》[1]、《英國藥典》[2]和《日本藥局方》[3]均收載了羅紅霉素的高效液相色譜（HPLC）檢測方法作為其含量測定方法，但由于試驗(yàn)條件過于苛刻，且使用了高鹽濃度的緩沖液，不利于儀器設(shè)備的使用與維護(hù)?！吨袊幍洹?010年版二部[4]收載的羅紅霉素的HPLC檢測方法，條件與國外藥典相比，降低了鹽濃度，使用了三乙胺為掃尾劑，但在應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)羅紅霉素色譜峰拖尾現(xiàn)象仍非常嚴(yán)重?；诖?，本文設(shè)計(jì)了正交試驗(yàn)，使用國產(chǎn)儀器，以期優(yōu)化液相色譜檢測條件，改善羅紅霉素的各種色譜參數(shù)，提高分離度和柱效，避免雜質(zhì)影響，以實(shí)現(xiàn)對該藥物含量測定準(zhǔn)確檢測的目的。

1 儀器與試藥

L6型液相色譜儀、WinLC色譜工作站（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；FiveEasy pH計(jì)（瑞士Mettler Toledo公司）。

羅紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號：130557-200502，含量：94.1%）；羅紅霉素化學(xué)中間體（浙江廣科藥業(yè)有限公司，批號：Z20070402，純度：94.9%）；羅紅霉素化工原料（山東濰坊三江醫(yī)藥化工有限公司，批號：20080911，純度：94.0%）；羅紅霉素原料藥（批號：H20058691，純度：94.6%，山東中亞制藥有限公司）；娃哈哈飲用純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；乙腈為色譜純，三乙胺、磷酸二氫銨、磷酸、氫氧化鈉均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

對照品溶液：取羅紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，加流動相溶解并定量稀釋制成每1mL中約含1mg的溶液，即得。

供試品溶液：取樣適量，精密稱定，加流動相溶解并定量稀釋制成每1mL中約含1mg的溶液，即得。

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

《中國藥典》[4]羅紅霉素含量測定色譜條件：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以0.067moL·L－1磷酸二氫銨溶液（用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至6.5）-乙腈（65∶35）為流動相，檢測波長為210nm。

綜合各國藥典所采用的羅紅霉素含量測定方法，應(yīng)用正交試驗(yàn)法對羅紅霉素含量測定方法進(jìn)行優(yōu)化，以流動相中磷酸二氫銨緩沖液濃度（A）、pH值（B）、三乙胺含量（C）、乙腈含量（D）4個(gè)因素，每個(gè)因素取3水平，分別以拖尾因子（T1）、理論板數(shù)（N）、保留時(shí)間（tR）、半峰寬（W1/2）等為考察指標(biāo)，采用正交表L9（34）進(jìn)行試驗(yàn)，優(yōu)化色譜條件，應(yīng)用極差分析法對結(jié)果進(jìn)行分析。因素水平各參量值見表1。

表1 因素水平表Tab1 Factors and levels

2.3 試驗(yàn)條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（250mm×4.6mm，5μm）；檢測波長：205nm；進(jìn)樣濃度：1mg·mL－1；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：30℃。流動相試驗(yàn)條件設(shè)置方案見表2。

表2 流動相設(shè)置方案表Tab2 Mobile phase program

2.4 試驗(yàn)結(jié)果

以上述試驗(yàn)條件分析樣品，分別記錄各試驗(yàn)的tR、峰面積、T1、W1/2、N及R，數(shù)據(jù)結(jié)果見表3。

表3 試驗(yàn)結(jié)果Tab3 Test results

2.4.1 以T1為指標(biāo)進(jìn)行結(jié)果分析見表4。

表中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別代表某一因素條件下同一水平的指標(biāo)之和；Ri為極差值，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中最大數(shù)減去最小數(shù)；T為指標(biāo)總和。由表4數(shù)據(jù)可知，各因素對指標(biāo)T1影響大小順序?yàn)镃、A、D、B。即，三乙胺含量對色譜峰的T1影響最大，緩沖液濃度和乙腈用量次之，而pH值的影響最小。由表4可知，以T1為指標(biāo)時(shí)，試驗(yàn)3條件（A3B3C3D3）為最佳水平。

2.4.2 以tR為指標(biāo)進(jìn)行結(jié)果分析見表5。

由表5可知，各因素對tR影響大小順序?yàn)锽、D、A、C。即pH值對色譜峰的tR影響最大，乙腈用量次之，緩沖液濃度再次，而三乙胺含量的影響最小。以tR為指標(biāo)時(shí)，試驗(yàn)9條件（A9B9C9D9）為最佳水平。

表4 以T1為指標(biāo)的分析結(jié)果Tab4 Results of analysis using tailing factor as evaluation index

表5 以tR為指標(biāo)的分析結(jié)果Tab5 Results of analysis using retention time as evaluation index

2.4.3 以W1/2為指標(biāo)進(jìn)行結(jié)果分析見表6。

表6 以W1/2為指標(biāo)進(jìn)行結(jié)果分析Tab6 Results of analysis using half-peak width as evaluation index

由表6可知，各因素對W1/2影響大小順序?yàn)镈、B、A、C。即乙腈用量對色譜峰的W1/2影響最大，pH值次之，緩沖液濃度再次，而三乙胺含量的影響最小。以W1/2為指標(biāo)時(shí)，試驗(yàn)7條件（A7B7C7D7）為最佳水平。

2.4.4 以N為指標(biāo)進(jìn)行結(jié)果分析見表7。

表7 以N為指標(biāo)進(jìn)行結(jié)果分析Tab7 Results of analysis using theoretical plate number as evaluation index

由表7可知，各因素對N影響大小順序?yàn)锽、C、A、D。即pH值對色譜峰的N影響最大，三乙胺含量次之，緩沖液濃度再次，而乙腈用量影響最小。以N為指標(biāo)時(shí)，試驗(yàn)3條件（A3B3C3D3）為最佳水平。

2.5 色譜條件的確定

據(jù)上述結(jié)果，綜合4個(gè)指標(biāo)的最佳試驗(yàn)水平，考慮到本試驗(yàn)旨在改善拖尾、提高柱效，故最終選取試驗(yàn)3的條件作為羅紅霉素HPLC含量測定的最優(yōu)水平，即：緩沖液濃度0.067mol·L－1、流動相pH值7.5、三乙胺含量0.3%、流動相中乙腈含量40%。最終確定色譜條件為：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.067mol·L－1磷酸二氫銨溶液（三乙胺含量0.3%，調(diào)pH值至7.5）-乙腈（60∶40）為流動相，檢測波長：205nm；柱溫：30℃；流速：1.0mL·min－1，進(jìn)樣量：20μL。

本法與2010年版《中國藥典》比較，改變了流動相的pH值，固定了三乙胺的加入量，并提高了乙腈在流動相中的比例。選用一國產(chǎn)C18色譜柱，使用本檢測方法，與2010年版《中國藥典》方法比較，結(jié)果見表8。

表8 2種方法各指標(biāo)結(jié)果比較Tab8 Comparison of evaluation index of 2kinds of methods

由表8可見，本法優(yōu)化的試驗(yàn)條件較2010年版《中國藥典》方法提高了柱效（N為《中國藥典》方法的2倍以上），在一定程度改善了色譜峰T1（由1.9降低到1.2），延長了tR（主峰tR延長了2min以上），色譜峰形更加尖銳且W1/2變窄。2種方法的色譜比較見圖1。

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證及應(yīng)用

采用本文優(yōu)化的羅紅霉素含量檢測條件，方法的最低檢測限為1.2μg·mL－1，定量限為4.1μg·mL－1；以色譜峰面積（y）與供試品溶液濃度（x）作圖，羅紅霉素檢測濃度在0.01～5.0mg·mL－1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y＝4845.3697x－35.4863（r2＝0.9999，n＝12）；精密度RSD為0.10%；低、中、高3個(gè)濃度的加樣回收率平均值為100.85%（RSD＝0.67%）；經(jīng)酸、堿、高溫、光照、氧化破壞后，所有雜質(zhì)與主峰的分離度良好。

圖1 2種方法色譜圖比較1.本法；2.《中國藥典》方法Fig1 Comparison of chromatograms of 2kinds of methods1.the method；2.method stated in Chinese Pharmacopoeia

采用本文優(yōu)化方法，以標(biāo)準(zhǔn)品對3批羅紅霉素樣品進(jìn)行了含量測定，并與現(xiàn)行《中國藥典》方法含量測定結(jié)果進(jìn)行了比較，結(jié)果見表9。

表9 3批羅紅霉素樣品含量測定結(jié)果Tab9 Content determination of 3batches of roxithromycin samples

3 討論

本文采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，對《中國藥典》收載的羅紅霉素含量測定的色譜條件中的流動相組成及配比進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，通過對緩沖液濃度、pH值、三乙胺含量、流動相中乙腈用量進(jìn)行正交試驗(yàn)，考察了各因素對羅紅霉素色譜行為的影響，為完善其檢測方法和條件提供了科學(xué)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

本法選取的檢測波長不同于現(xiàn)行藥典的210nm，而改為205nm，主要是考慮羅紅霉素在紫外光區(qū)具有末端吸收，由于流動相中主要組成為水和乙腈，二者截止波長分別為200、190nm，經(jīng)試驗(yàn)分析其對測定結(jié)果無干擾?！睹绹幍洹贰ⅰ稓W洲藥典》和《日本藥典》均選取205nm作為檢測波長，故本法最終也選取205nm作為檢測波長，提高了響應(yīng)值。

方法學(xué)研究結(jié)果證明，本論文建立的HPLC檢測方法簡便、準(zhǔn)確，具有較好的科學(xué)性與實(shí)用性，是對藥典方法的完善和提高。

利用本文建立的HPLC檢測分析方法對羅紅霉素原料藥進(jìn)行了含量測定，試驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)化后方法能夠滿足其質(zhì)量控制的要求，有效地改善了羅紅霉素色譜峰拖尾嚴(yán)重的情況，拖尾因子較小，較2010年版《中國藥典》收載方法具有柱效高、對稱性好等優(yōu)點(diǎn)，保證了含量測定結(jié)果具有更高的準(zhǔn)確性。

[1] European Directorate for the Quality of Medicine.The European Pharmacopoeia6.0[S].Strasbourg，F(xiàn)rance：the Directorate for the Quality of Medicine of the Council of Europe，2005：1146.

[2] The British Pharmacopoeia Commission.The British Pharmacopoeia[S].London：the Stationary Office，2007：303.

[3] Society of Japanese Pharmacopoeia.The Japanese Pharmacopoeia Fifteenth Edition[S].Tokyo：Society of Japanese Pharmacopoeia，2001：738.

[4] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：462.

Optimization of HPLC Method of Roxithromycin inChinese Pharmacopoeia

YANG De-zhi，XU Wei-sheng，ZHANG Li，YANG Shi-ying，LV Yang
（Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College，Beijing 100050，China）

OBJECTIVE：To optimize mobile phase condition of content determination of roxithromycin by HPLC，and to improve peak tailing.METHODS：Using buffer concentration，pH value of mobile phase，amount of triethylamine and acetonitrile as factors and with tailing factor（T1），retention time（tR），half-peak width（W1/2）and theoretical plate number（N）as index，the determination method was optimized by orthogonal and compared with content determination method stated inChinese Pharmacopeia（2010edition）.RESULTS：Optimal condition was as follows：C18column was used，mobile phases consisted of 0.067mol·L－1ammonium dihydrogen phosphate（0.3%TEA，pH＝7.5）-acetonitrile（60∶40）at flow rate of 1.0mL·min－1and the detection wavelength was set at 205nm.The injection volume was 20μL and the column temperature was 30℃.Optimized method was compared with that stated inChinese Pharmacopoeia.T1were 1.2and 1.9；tRwere 14.133min and 12.383min；W1/2were 0.400and 0.533；Nwere 6916and 2987.CONCLUSION：Compared with the current method inChinese Pharmacopoeia（2010edition），the optimal method is better in term of column efficiency，prolonging retention time and improving peak tailing.

Orthogonal design；HPLC；Roxithromycin；Optimization；Mobile phase；Content determination；Chinese pharmacy

R927.2；R978.1+5

A

1001-0408（2011）17-1604-03

Δ“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)“十一五”計(jì)劃項(xiàng)目（2009ZX09501-02）；衛(wèi)生行業(yè)科研專項(xiàng)（200902008-02）；國家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高研究課題（1680）

＊實(shí)習(xí)研究員。研究方向：藥物分析。電話：010-63161258。E-mail：ydz@imm.ac.cn

#通訊作者：研究員，博士研究生導(dǎo)師。研究方向：藥物分析。電話：010-63165212。E-mail：luy@imm.ac.cn

2010-07-16

2010-09-10）