聶績，黃華

（重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院高校藥物工程研究中心，重慶市 400016）

氯霉素固體脂質(zhì)納米粒的制備及質(zhì)量評價

聶績＊，黃華#

（重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院高校藥物工程研究中心，重慶市 400016）

目的：制備氯霉素固體脂質(zhì)納米粒（CAP-SLN）并考察其質(zhì)量。方法：選取CAP與甘油棕櫚酸硬脂酸酯（Precirol ATO 5）比例（藥脂比）、泊洛沙姆含量、乳化溫度和初乳-分散相的體積比為考察因素，包封率和載藥量為評價指標(biāo)，設(shè)計正交試驗并優(yōu)化處方，利用乳化蒸發(fā)-低溫固化法制備CAP-SLN；同時以粒徑、Zeta電位、包封率、載藥量、穩(wěn)定性及體外釋放度為指標(biāo)評價其質(zhì)量。結(jié)果：最佳制備處方藥脂比為1∶10，泊洛沙姆含量為2%，乳化溫度為70℃，初乳-分散相的體積比為1∶7。所制納米粒平均粒徑為227nm，Zeta電位為－30.5mV，平均包封率為65.9%，平均載藥量為6.59%；于4℃環(huán)境中考察30d，其包封率、粒徑無顯著變化，25℃環(huán)境中包封率顯著降低、粒徑明顯增大；在前4h內(nèi)有明顯突釋現(xiàn)象，藥物累積釋放率達(dá)58.86%，48h時累積釋放率達(dá)85.09%，體外釋藥行為符合Weibull方程。結(jié)論：該制劑處方設(shè)計和工藝方法可行，制劑質(zhì)量符合要求，可達(dá)到緩釋效果。

氯霉素；固體脂質(zhì)納米粒；甘油棕櫚酸硬脂酸酯；體外釋放度

固體脂質(zhì)納米粒（Solid lipid nanoparticles，SLN）是一種新型納米粒給藥系統(tǒng)[1]，具緩/控釋特性，可提高藥物生物利用度及其穩(wěn)定性等[2，3]，適用于親脂性藥物的包裹[4]。氯霉素（Chloramphenicol，CAP）是治療沙眼和結(jié)膜炎等眼部疾病最常用的抗生素之一，使用中為保證藥效需每日給藥3～5次，在全身用藥時不良反應(yīng)主要表現(xiàn)為骨髓抑制與再生障礙性貧血，其在生產(chǎn)和貯存中可產(chǎn)生二醇物，使抗菌活性降低。為此，本文選用甘油棕櫚酸硬脂酸酯（Precirol ATO 5）為載體材料，以CAP為模型藥制備CAP-SLN，并對其制備工藝、理化性質(zhì)和體外釋放度進(jìn)行考察，以期達(dá)到緩釋、減少給藥次數(shù)、降低毒副反應(yīng)、提高生物利用度的目的，為進(jìn)一步研制CAP-SLN眼用混懸液提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Zetasizer Nano ZS90激光粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司）；Hitachi S-3400掃描電鏡（日本日立公司）；UV-3105型紫外可見分光光度計（日本島津公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；82-2恒溫磁力攪拌器（上海青浦滬西儀器廠）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（涿州市國華電器有限責(zé)任公司）；RCZ-6B1型藥物溶出儀（上海黃海藥檢儀器廠）。

1.2 試藥

CAP原料藥（鄭州二七長興化工物資有限公司，批號：090625，含量：98.2%）；CAP標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號：130555-200602，含量：99.4%）；Precirol ATO 5（法國Gattefosse公司）；蛋黃卵磷脂（北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠）；泊洛沙姆（F68，德國Basf公司）；Sephadex-G50（瑞典Pharmacia公司）；無水乙醇（重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司化學(xué)試劑廠）；雙蒸水、CAP-SLN（規(guī)格：0.05%）均由重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院實驗室制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 CAP-SLN的制備

采用乳化蒸發(fā)-低溫固化的方法制備。具體操作：精密稱取處方量CAP原料藥、Precirol ATO 5和蛋黃卵磷脂，置于25mL具塞錐形瓶中，加入10mL無水乙醇，超聲約1min，使蛋黃卵磷脂充分溶解，置于70℃恒溫水浴鍋中保持恒溫，構(gòu)成有機(jī)相。精密稱取處方量的泊洛沙姆，溶于適量的水中，使恒溫保持在70℃，構(gòu)成水相。用預(yù)熱至約70℃的注射器緩慢地將有機(jī)相注入1300r·min－1攪拌速度下的恒溫水相中，繼續(xù)以此速度攪拌2～3h，形成半透明的初乳，迅速倒入0～2℃的一定量的分散相（與上述水相成分一致）中，繼續(xù)攪拌2h，即得到半透明、顯藍(lán)色乳光的CAP-SLN溶液。

空白SLN的制備方法同上述CAP-SLN的制備方法，只是未加入CAP原料藥。

2.2 含量測定

用無水乙醇制備濃度為15μg·mL－1的CAP原料藥溶液，在200～400nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，其最大吸收波長為273nm。精密稱取一定量的空白SLN溶液，用無水乙醇破乳，并稀釋至50mL，進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)在273nm波長處無紫外吸收，表明空白輔料對測定無干擾，方法專屬性好。故采用紫外分光光度法測定含量，光譜圖見圖1。

圖1 紫外吸收光譜圖A.CAP原料藥；B.空白SLNFig1 UV absorption spectrumA.CAP material；B.blank SLN

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密稱取CAP標(biāo)準(zhǔn)品5.0mg，置于50mL容量瓶中，用無水乙醇制備成濃度為0.1mg·mL－1的CAP標(biāo)準(zhǔn)品溶液，精密量取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于25mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋成濃度為2、4、8、12、16和20μg·mL－1系列溶液，以無水乙醇為空白，于273nm波長處測定吸收度（A）。以A對標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度（c）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：A＝0.0303c+0.0135（r＝0.9999）。結(jié)果，CAP檢測濃度的線性范圍為2～20μg·mL－1。

2.2.2 回收率與精密度試驗：用無水乙醇制備4、12、20μg·mL－13種濃度的CAP原料藥溶液，各3份，加入相應(yīng)處方量的空白SLN，測定A，計算回收率。結(jié)果平均回收率分別為100.4%、99.9%、99.8%，RSD分別為0.52%、0.27%、0.16%。選取同樣的4、12、20μg·mL－13種濃度的CAP原料藥溶液，各3份，測定A，計算日內(nèi)RSD（同日內(nèi)測5次）和日間RSD（連續(xù)5d測定）。日內(nèi)RSD分別為1.00%、0.48%、0.30%，日間RSD分別為0.71%、0.26%、0.11%?；厥章试囼灲Y(jié)果見表1。

2.3 包封率測定

表1 回收率試驗結(jié)果（n＝3）Tab1 Results of recovery tests（n＝3）

采用葡聚糖凝膠柱分離-紫外分光光度法測定CAP-SLN的包封率。

精密量取1.0mL的CAP-SLN溶液，緩慢置于已裝好的Sephadex-G50凝膠柱（1.5cm×30cm）上，經(jīng)預(yù)試驗考察后，選擇流動相為水，流速為1.0mL·min－1，用試管收集流出液，每2mL收集1管，繪制分離曲線，詳見圖2。

圖2 CAP-SLN和游離CAP分離曲線Fig2 Elution curves of CAP-SLN and free CAP

收集、合并有藍(lán)色乳光溶液，置于25mL棕色容量瓶中，用無水乙醇破乳并稀釋，以紫外分光光度法在273nm波長處測定A1。另精密量取1.0mL的CAP-SLN溶液，置于25mL棕色容量瓶中，用無水乙醇破乳并稀釋，在273nm波長處測定吸光度A2。

2.4 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定了主要影響因素：即藥脂比（CAP與Precirol ATO 5的比例）（A）、泊洛沙姆含量（B，%）、乳化溫度（C，℃）和初乳-分散相的體積比（D），以正交試驗表L9（34）進(jìn)行試驗，以包封率和載藥量為評價指標(biāo)進(jìn)行考察。正交試驗因素水平見表2，正交設(shè)計試驗結(jié)果見表3（由表2、表3可見，極差R反映各因素對指標(biāo)影響的程度，R越大，影響程度越大）。

表2 因素水平表Tab2 Factors and levels

由表3結(jié)果分析，以包封率為衡量指標(biāo)，影響程度排列為A＞B＞D＞C，其中A3＞A2＞A1，B2＞B3＞B1，C2＞C3＞C1，D3＞D1＞D2，得出最佳優(yōu)化處方A3B2C2D3。以載藥量為衡量指標(biāo)，影響程度排列為A＞B＞D＞C，其中A1＞A2＞A3，B2＞B3＞B1，C2＞C3＞C1，D3＞D2＞D1，得出最佳優(yōu)化處方 A1B2C2D3。從試驗結(jié)果得出，當(dāng)藥脂比較大時（1∶15），藥物包封率較高；藥脂比較小時（1∶5），其載藥量較高。經(jīng)過綜合考慮，確定A2為最佳藥脂比，則最佳優(yōu)化處方為A2B2C2D3，即藥脂比為1∶10，泊洛沙姆含量為2%，乳化溫度為70℃，初乳-分散相的體積比為1∶7。按最優(yōu)處方制備3批樣品，測得包封率分別為65.6%、66.3%和65.7%，平均包封率為65.9%，RSD＝0.57%；載藥量分別為6.56%、6.63%、6.57%，平均載藥量為6.59%，RSD＝0.57%。

表3 正交設(shè)計試驗結(jié)果Tab3 Results of orthogonal design

2.5 形態(tài)觀察

按最優(yōu)處方制備的CAP-SLN溶液，于掃描電鏡下觀察，其形態(tài)為大小較均勻的類球形，詳見圖3。

圖3 CAP-SLN掃描電鏡照片（×30000）Fig3 Transmission electron microphotograph of CAP-SLN（×30000）

2.6 粒徑和Zeta電位

用適量水稀釋按最優(yōu)處方制備的CAP-SLN溶液，用Zetasizer Nano ZS90激光粒度儀測定粒徑和Zeta電位，測得平均粒徑為227nm，Zeta電位為－30.5mV。粒徑分布與Zeta電位結(jié)果詳見圖4、圖5。

2.7 穩(wěn)定性考察

重新制備3批樣品（批號：100325-1、100325-2、100325-3），分別放入4℃和25℃的環(huán)境中，于0、5、15、30d觀察其平均包封率和平均粒徑的變化，考察其穩(wěn)定性，結(jié)果見表4。

表4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Tab4 Results of stability tests

由表4可見，CAP-SLN在4℃儲存溫度下包封率和粒徑無顯著變化，穩(wěn)定性良好；在25℃儲存溫度下包封率顯著降低，粒徑明顯增大，穩(wěn)定性較差。

2.8 體外釋放度考察

精密量取4.0mL的CAP-SLN溶液，放入預(yù)處理好的透析袋中，兩端用細(xì)線系緊，放入裝有200mL釋放介質(zhì)的溶出杯中。根據(jù)眼內(nèi)pH為7.4、眼表溫度為34℃的常規(guī)，本試驗采用以下條件：釋放介質(zhì)為pH 7.4磷酸鹽緩沖液，水浴溫度為34℃，轉(zhuǎn)速為100r·min－1。將釋放介質(zhì)分別于0.5、1、2、4、8、12、24、48h取樣5mL，每次取液后補(bǔ)加同體積的釋放介質(zhì)，用紫外分光光度法進(jìn)行測定。采用相同方法考察CAP原料藥的體外釋放度，CAP原料藥和CAP-SLN的累積釋放曲線結(jié)果見圖6。

圖6 CAP原料藥和CAP-SLN累積釋放曲線Fig6 Drug release curve of CAPand CAP-SLN

由圖6可見，CAP原料藥在4h內(nèi)的累積釋放率已達(dá)到95.6%；CAP-SLN在前4h內(nèi)有明顯的突釋現(xiàn)象，藥物累積釋放率達(dá)到58.86%，而后緩慢釋放藥物，48h時累積釋放率達(dá)85.09%。將CAP-SLN累積釋放量（Q）和時間（t）進(jìn)行擬合，結(jié)果符合Weibull方程：

3 討論

3.1 CAP-SLN制備方法

本試驗采用乳化蒸發(fā)-低溫固化的方法制備樣品，把藥物、聚合材料和表面活性劑溶于半極性的且與水互溶的溶劑中，然后在磁力攪拌的基礎(chǔ)上將溶液注入非溶劑（一般為含表面活性劑的水）中。由于溶劑的快速擴(kuò)散，納米粒隨即形成。因CAP略溶于水，藥物大部分存在于Precirol ATO 5所形成的乳滴中，在泊洛沙姆和蛋黃卵磷脂的乳化作用下形成CAP的納米乳液。把乳液分散于0～2℃冰水中，乳液的溫度急劇降到Precirol ATO 5熔點(diǎn)以下，乳液凝固成固態(tài)Precirol ATO 5納米粒。如此可提高CAP的穩(wěn)定性，避免產(chǎn)生化學(xué)降解。但也有人認(rèn)為SLN是熱力學(xué)不穩(wěn)定系統(tǒng)，在較短的時間內(nèi)就會產(chǎn)生粒徑的增大、粒子聚合或膠凝[5]。Zeta電位也與納米粒體系的穩(wěn)定性密切相關(guān)，在－60～－30mV范圍內(nèi)體系物理性質(zhì)穩(wěn)定，因此測定Zeta電位可以預(yù)測納米粒體系的儲藏穩(wěn)定性[6]。本試驗制備的CAP-SLN的Zeta電位值為－30.5mV，屬熱力學(xué)穩(wěn)定系統(tǒng)。該制劑處方設(shè)計和工藝方法可行，制劑質(zhì)量符合要求，可達(dá)到緩釋效果。

3.2 輔料和溶劑的選擇

本試驗采用的脂質(zhì)是Precirol ATO 5。在考察脂質(zhì)材料對CAP-SLN性質(zhì)的影響時，選擇了4種脂質(zhì)材料：硬脂酸、單硬脂酸甘油酯、Compritol 888ATO和Precirol ATO 5。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硬脂酸作載體的CAP-SLN穩(wěn)定性非常差，儲存于4℃條件下，在4h內(nèi)就開始渾濁，有絮狀物產(chǎn)生；單硬脂酸甘油酯作載體的CAP-SLN穩(wěn)定性好，但包封率低；Compritol 888ATO作載體的CAP-SLN包封率高，但穩(wěn)定性低；相比而言，PrecirolATO 5作載體的穩(wěn)定性和包封率均較好。Precirol ATO 5[7]其主要成分是硬脂酸和棕櫚酸，毒性低于高分子合成材料，在體內(nèi)可以降解且生理相容性好，同時理化性質(zhì)穩(wěn)定，可改變單一脂質(zhì)晶格的高度有序性，使藥物更易鑲嵌于脂質(zhì)晶格中，或是存在于脂質(zhì)的脂肪酸鏈間、脂質(zhì)層間，有利于藥物的穩(wěn)定。另外該材料熔點(diǎn)為60℃，相對較低，有利于CAP-SLN的制備和理化性質(zhì)的穩(wěn)定。

蛋黃卵磷脂是細(xì)胞膜組成成分，毒性低，可以在體內(nèi)降解且生理相容性良好，當(dāng)卵磷脂和泊洛沙姆合用時，泊洛沙姆可插入卵磷脂單分子層形成緊密充填的混合層，從而減小粒徑，提高穩(wěn)定性，故選其作為表面活性劑[8，9]。溶劑選擇的是無水乙醇，滿足半極性且與水互溶的性質(zhì)。蛋黃卵磷脂也易溶于無水乙醇，有利于油相混合均勻。

3.3 體外釋放度的測定

本試驗采用透析法考察CAP-SLN的體外釋放規(guī)律。眼用制劑的體外釋放度考察應(yīng)遵循眼表溫度，所以選擇34℃。從體外釋放曲線可見，樣品在初期有突釋的現(xiàn)象，可能是由于存在未包入脂質(zhì)材料的游離CAP，而產(chǎn)生的突釋現(xiàn)象。藥物的快速釋放，可使CAP在眼部快速達(dá)到抑菌濃度，產(chǎn)生藥效。由于大部分的藥物包裹進(jìn)入脂質(zhì)材料的骨架結(jié)構(gòu)中，從而緩慢地釋放藥物，所以8h后釋放趨于平穩(wěn)，達(dá)到了較好的緩釋目的。后續(xù)試驗將對CAP-SLN眼用制劑在兔眼內(nèi)的藥動學(xué)進(jìn)行研究，考察其對兔眼的刺激性、在兔眼內(nèi)的滯留時間和在兔眼淚液及房水內(nèi)的藥動學(xué)，對其在體內(nèi)實現(xiàn)緩釋、降低毒副反應(yīng)、提高生物利用度的作用進(jìn)行驗證。

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Preparation and Quality Evaluation of Chloramphenicol Solid Lipid Nanoparticles

NIE Ji，HUANG Hua
（Chongqing Engineering Research Center for Medicine，College of Pharmacy，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

OBJECTIVE：To prepare Chloramphenicol solid lipid nanoparticles（CAP-SLN）and to study the quality of it.METHODS：The preparation technilogy of CAP-SLN was optimized by orthogonal test with the entrapment efficiency and drug loading amount as index and with proportion of CAP to Precirol ATO 5（drug-to-lipid ratio），amount of poloxamer，emulsifying temperature，volume ratio of emulsion-disperse phase as factors.CAP-SLN was prepared by emulsification evaporation-low temperature solidification technique.The quality of preparation was evaluated with particle size，Zeta potential，drug-loading amount，stability and in vitro drug release rate as index.RESULTS：The optimal formulation was as follows：drug-to-lipid ratio of 1∶10，the weight of poloxamer of 2%，emulsifying temperature of 70℃，drug-to-lipid of 1∶7.The mean diameter of CAP-SLN was 227nm.The zeta potential was－30.5mV.The entrapment efficacy was 65.9%.The average drug-loading amount was 6.59%.CAP-SLN could keep stable at 4℃at least for one month.The entrapment efficacy of CAP-SLN at 25℃decreased significantly while particle size increased.The burst release of CAP-SLN was found during the former 4h.The drug release rate of it was 58.86%at 4h and reached 85.09%at 48h.The in vitro drug release behavior was in line with Weibull equation.CONCLUSION：The preparation technique and formulation are practicable.CAP-SLN is up to quality standard and can achieve sustained-release effects.

Chloramphenicol；Solid lipid nanoparticles；Precirol ATO 5；In vitro drug release rate

R927.11；R944.1+6

A

1001-0408（2011）17-1598-04

＊碩士研究生。研究方向：速釋及緩、控釋制劑。電話：023-68485078

#通訊作者：教授，碩士研究生導(dǎo)師。研究方向：速釋及緩、控釋制劑。電話：023-68485078

2010-08-03

2010-09-20）

·藥品監(jiān)督·