張文東，趙煥云，呂 粵，程萬明，岳 亮，張應(yīng)國，張富強

云南省2006－2010年狂犬病病毒N和G基因分子結(jié)構(gòu)特征分析＊

張文東1，趙煥云1，呂 粵1，程萬明1，岳 亮1，張應(yīng)國1，張富強2

目的了解云南省狂犬病毒的流行情況以及街毒株N、G基因結(jié)構(gòu)特征，為有效控制狂犬病疫情提供初步科學(xué)依據(jù)。方法對云南省2006－2010年10株狂犬病街毒株N、G基因進行全基因克隆、測序，并與已知國內(nèi)外代表毒株核苷酸及推導(dǎo)氨基酸進行序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果序列分析表明所研究的10個云南毒株與Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ型代表毒株N、G基因核苷酸序列同源性分別為72．1%～78．5%、58．4%～71．0%，與基因Ⅰ型毒株序列同源性為85．2%～90．1%、82．7～99．6%，云南毒株之間核苷酸序列同源性為89．3%～99．2%、86．0～99．6%。云南10個毒株均為基因Ⅰ型和血清1型毒株，分為2個進化分支，除YNTC06與GXN119和HM88單獨屬于分支Ⅲ外，其余云南毒株均分布在分支Ⅰ上，且進一步分為3個小亞分支。遺傳進化分析表明，各毒株氨基酸位點均存在不同程度的變異，其中YNTC06在360、369、375等多個NP抗原位點存在變異；云南毒株在GP330、333位毒力決定位點未發(fā)生變異，均為強毒株。結(jié)論云南狂犬病毒屬于基因Ⅰ型，存在2個分支；云南狂犬病毒NP和GP存在特異性氨基酸變異位點，其基因結(jié)構(gòu)及變異、亞組群劃分與地理位置無相關(guān)性。

狂犬病毒；核蛋白基因（N）；糖蛋白基因（G）；分子結(jié)構(gòu)特征

狂犬?。≧abies）是由狂犬病毒（Rabies virus， RV）感染引起的一種人畜共患傳染病［1］，全世界每年報告的狂犬病死亡人數(shù)約有55 000例，亞洲和非洲是人狂犬病發(fā)生最為嚴重的地區(qū)，占全世界總死亡人數(shù)的99%［2］。我國屬狂犬病高發(fā)國家，人狂犬病95%以上由犬咬傷引起，2006－2009年因狂犬病死亡人數(shù)平均每年在3 000人左右。云南省是狂犬病高發(fā)區(qū)，近幾年來不斷出現(xiàn)“瘋狗”咬人事件，已成為云南的公共衛(wèi)生問題和社會問題。為了解云南省狂犬病病毒遺傳特點和進化規(guī)律，2006－2010年我們對本實驗室確定的10株狂犬病病毒株N和G基因進行RT－PCR擴增、克隆、測序，并與已知國內(nèi)外代表毒株進行序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析，以期闡明云南狂犬病毒株N和G基因結(jié)構(gòu)特征及與已知毒株的遺傳相關(guān)性，為云南狂犬病病毒分子流行病學(xué)、致病機制等方面的研究奠定基礎(chǔ)，同時為云南狂犬病防控提供病原學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 狂犬病病毒街毒樣品 對云南省動物疫病預(yù)防控制中心收集的2006－2010年疑似狂犬病的犬腦組織和棉拭子進行RT－PCR和套式PCR檢測，根據(jù)不同地域和時間選出10份具有代表性的陽性樣品。詳細信息見表1。

1．2 質(zhì)粒與菌種 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，由本實驗室制備、保存；p MD18－T Vector購自寶生物工程（大連）有限公司。

1．3 主要試劑 病毒RNA／DNA提取試劑盒（Body Fluid Viral DNA／RNA miniprep Kit）購自Axygen公司；DH5a感受態(tài)快速制備試劑盒、Ta KaRa One Step RNA PCR Kit（AMV）、DL2000DAN Marker均購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA膠回收試劑盒及小量質(zhì)粒柱式提取試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司。氯仿、異丙醇采用分析純試劑。

表1 10份陽性樣品時間和地域分布Table 1 Distribution of 10 positive samples by time and geography

1．4 引物設(shè)計與合成 根據(jù)已知狂犬病毒N基因和G基因測序數(shù)據(jù)，參照近年國外發(fā)表的引物序列，在線設(shè)計（http：／／www．yeastgenome．org／cgibin／web－primer）N、G 基因克隆引物（表2）。質(zhì)粒測序引物參照試劑手冊提供的序列。由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表2 N和G基因克隆引物Table 2 Oligonucleotide primers used in N and G gene cloning

1．5 核酸提取 采用病毒RNA／DNA提取試劑盒，參照操作手冊，分別提取組織樣品、弱毒疫苗（陽性對照）、健康組織樣品（陰性對照）的總RNA，加RNA酶抑制劑后－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．6 狂犬病病毒的檢測 根據(jù)本實驗室已建立的狂犬病病毒檢測方法，經(jīng)RT－PCR及套式PCR擴增后，產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，凝膠成像儀系統(tǒng)觀察結(jié)果，確定陽性樣品。

1．7 N和G基因的擴增、克隆 采用N、G基因克隆引物，RT－PCR擴增N和G基因，產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，凝膠切割純化，定量，確定目的基因濃度后，按T載體克隆試劑盒提供的手冊進行克隆反應(yīng)。

1．8 重組質(zhì)粒構(gòu)建和鑒定 取10μL克隆反應(yīng)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞后，涂布Ampcilin抗性平板過夜，挑取孤立的白色菌落，采用PCR鑒定陽性菌落。陽性菌落增殖培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，再經(jīng)PCR進行重組質(zhì)粒鑒定，－20℃保存。

1．9 序列分析 陽性重組質(zhì)粒送北京三博科技有限公司進行測序。采用DNAMAN Version 5．2．2軟件進行序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié) 果

2．1 狂犬病病毒檢測及N、G基因擴增 對收集到的2006－2010年疑似狂犬病的犬腦組織和唾液棉拭子進行RT－PCR和套式PCR檢測，對篩選出的10份陽性樣品用N、G基因測序引物進行一步法RT－PCR擴增，然后對產(chǎn)物進行凝膠電泳，與DL2000 DNA Marker相比較，擴增出與預(yù)期片段大小相符片段，結(jié)果見圖1。

圖1 云南狂犬病毒株N和G基因RT－PCR結(jié)果Fig．1 RT－PCR results of N and G genes of Yunnan rabies virus strains M．DL2 000 DNA marker；1、2、3 N gene；4、5、6 G gene；1、4：positive control；3、6：negative control

2．2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 N、G基因與18－T載體連接轉(zhuǎn)化后，涂布Ampcilin抗性平板過夜培養(yǎng)后菌落數(shù)分別為41個和37個，空白質(zhì)粒自連接對照板無菌落生長。分別挑取3個孤立菌落，采用目的片段引物和質(zhì)粒引物經(jīng)PCR鑒定均為陽性。結(jié)果見圖2。

圖2 N、G基因重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果Fig．2 PCR results of N and G genes Recombinant Plasmid M．DL2 000 DNA marker；1、2：N gene Recombinant Plasmid；3、4：G gene Recombinant Plasmid；1、3 M13－47／RV－M Primer；2、4：NF／NR、GF／GR Primer

2．3 序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析 采用DNAMAN Version 5．2．2軟件，以狂犬病毒基因I型中的疫苗株作為參考毒株，以Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ基因型代表毒株作為外群對云南省2006－2010年間不同地州分離到的10株狂犬病毒株進行序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析。

2．3．1 N基因序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析 所測10個云南毒株與Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ型代表毒株N基因核苷酸序列同源性為72．1%～78．5%，與PV、CTN及3aG株的同源性為85．2%～90．1%，云南毒株之間的同源性為89．3%～99．2%，屬于基因Ⅰ型和血清1型毒株（參考毒株見表3）。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，基因Ⅰ型毒株至少存在5～6個獨立的進化分支，本研究所測的10個云南毒株除了YNTC06與我國廣西（GXN119）毒株和泰國人毒株（HM88）單獨屬于分支Ⅲ外，其余云南毒株均分布在分支Ⅰ上，且進一步分為3個小的亞分支，其中YNMD06與上海（SH06）、浙江（ZJWx0）毒株屬于一個進化亞分支，同 源性為 97．3% ～99．3%；YNH H10、YNZT07與安徽（AHFY1）、湖南（Hu NDK1）、江蘇（JSWx1）屬于另一亞分支，同源性為97．2%～99．1%；其余云南毒株與我國貴州（GZQx5）、廣西（GXY166、GXYue1）等地毒株則屬于第三亞分支，同源性為97．3%～99．6%。固定毒株、疫苗毒株、屬于不同的進化分支，可劃分為不同亞組群（圖3）。

圖3 狂犬病毒N基因系統(tǒng)發(fā)育分析Fig．3 Phylogenetic analysis based on N gene of Rabies virus

2．3．2 G基因序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析 所測10個云南狂犬病毒株G基因核苷酸序列同源性為86．0～99．6%，與基因Ⅰ型毒株核苷酸序列同源性為82．7～99．6%，與其它6個基因型代表毒株（Lagosbat5，Mokolacat，Duvenhage，EBLV－1，EBLV－2，ABLV）核苷酸序列同源性為58．4%～71．0%。G基因建立的分子系統(tǒng)進化樹與N基因建立的進化樹毒株之間呈現(xiàn)出同樣的進化關(guān)系。云南毒株（YNTC06）與泰國毒株（HM88）G基因核苷酸的同源性為94．7%，屬于第Ⅲ分支；其余云南毒株均分布在分支Ⅰ上，其中YNHH10、YNZT07與安徽毒株（AHFY1）同源性高達99．2%～99．6%，立為第一 亞 分 支；YNMD06 與 上 海 （SH06）、江 蘇（JSWx1）、浙 江 （ZJWz0）同 源 性 為 99．3% ～99．4%，屬 于 另 一 進 化 亞 分 支；YNZT09、YNHH09、YNKM10、YNNJ08、YNQJ07、YNQJ08與貴州（GZQx5）、廣西（GXY166、GXYue1）等地毒株屬于第三亞分支。從G基因的進化樹中發(fā)現(xiàn)，各個毒株之間呈現(xiàn)了比較復(fù)雜的進化關(guān)系，同一基因型的毒株之間形成了更多的平行組群，呈現(xiàn)出平行的進化關(guān)系，見圖4。

表3 序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析中引用毒株Table 3 rabies virus strains in the sequence alignment and phylogenetic analysis

2．4 氨基酸變異位點分析

圖4 狂犬病毒G基因系統(tǒng)發(fā)育分析Fig．4 Phylogenetic analysis based on G gene of Rabies virus

2．4．1 NP氨基酸變異位點分析 NP至少存在4個抗原區(qū)，抗原區(qū)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分別定位于358～367、76～90、313～337、359～383位區(qū)段。通過比對推導(dǎo)的N蛋白氨基酸序列，大多數(shù)均為同義變異，除YNTC06和浙江毒株（ZJWZ0）在抗原區(qū)Ⅰ的360位氨基酸發(fā)生變異外（F→S），其余基因Ⅰ型毒株抗原區(qū)Ⅰ未發(fā)生變異（表4）；云南毒株與其它毒株比較，在抗原區(qū)Ⅱ未發(fā)生變異；除YNZT09在抗原區(qū)Ⅲ的317位發(fā)生變異外（C→S），其余基因Ⅰ型毒株在該位點都未發(fā)生變異；YNTC06在抗原區(qū)Ⅳ的360（F→S）、369（Y→H）、375（T→M）、379（L→V）位存在變異，其余云南毒株在該抗原區(qū)未發(fā)生差異；NP氨基端對抗原區(qū)Ⅳ也存在影響，如當(dāng)氨基端第13位谷氨酰胺（Q）突變?yōu)榫彼幔≧）后，會降低單克隆抗體的識別能力，云南毒株NP第13位氨基酸未發(fā)生變異。NP具有一個共同的389位絲氨酸（S）磷酸化位點和一個次要的375位蘇氨酸（T）磷酸化位點，其存在與否直接影響NP與先導(dǎo)RNA的結(jié)合以及病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。云南毒株中僅YNTC06在375位磷酸化位點存在變異，參考毒株中GXN119和HM88在該位點也存在同樣變異（T→M）。

與國內(nèi)外參考毒株相比，在所測得的10個云南狂犬病毒株中，YNTC06氨基酸位點發(fā)生變異最多，其他云南毒株也存在多個氨基酸位點的變異（見表4）。

表4 云南狂犬病毒株NP抗原變異位點Table 4 Mutations of antigen sites on nucleoprotein of rabies virus strains from Yunnan

2．4．2 GP氨基酸變異位點分析 研究表明狂犬病毒G蛋白至少具有3個抗原決定簇，分別為GⅠ（226～231）、GⅡ（34～42、198～200）、GⅢ（330～357），GP的抗原性變化常常是由抗原決定簇某些位點的變異造成的。本研究對3個抗原決定簇內(nèi)的重要位點進行了比較，發(fā)現(xiàn)僅有YNTC06在Ⅱ群中的39位（S→P）及Ⅲ群中的332位（I→V）、355位（V→A）存在變異，其余云南毒株在關(guān)鍵性抗原位點均未發(fā)生變異，說明各野毒株抗原性變化不明顯。

糖基化是糖蛋白的一個重要特點，不同狂犬病毒糖基化位點的數(shù)目和位置不完全相同，可能存在的糖基化位點位于37、70、247、319、465、480位氨基酸。YNTC06的39位氨基酸由絲氨酸（S）變?yōu)楦彼幔≒），導(dǎo)致37位糖基化位點消失，僅存在319位這一個糖基化位點，其余云南毒株和國內(nèi)外參考毒株都有37位和319位兩個糖基化位點。

GP的第189～214氨基酸區(qū)段可與乙酰膽堿受體（Ach R）結(jié)合，與病毒的組織嗜性有關(guān)，所測毒株除YNZT07在186位為精氨酸（R）外，其余毒株均為甘氨酸（G）；YNTC06在204位為絲氨酸（S），其它云南毒株204位為甘氨酸（G），而通常此位點為絲氨酸（S）、天冬酰胺（N）或天冬氨酸（D）。所測10個云南毒株在330、333位毒力位點未發(fā)生變異，均為強毒株。云南毒株 GP信號肽區(qū)－2、－5、－16氨基酸位點存在變異；在成熟的G蛋白肽上共有34個氨基酸位點與參考毒株比較存在差異，其中僅YNTC06毒株就有21個位點發(fā)生了特異性變異。

3 討 論

據(jù)我國衛(wèi)生部報道，近幾年我國法定公布的傳染病中狂犬病發(fā)病率居首位，呈急劇上升趨勢，自2003年以來，每年報道的病例均在2 500例以上，因此，預(yù)防和控制狂犬病已成為目前亟待解決的難題之一。國內(nèi)外對狂犬病的流行病學(xué)及分子流行病學(xué)研究報道較多［3－7］。云南省自2007年后陸續(xù)有狂犬病病例的報道［8－9］，本研究就云南省2006－2010年間的10株狂犬病病毒株N和G基因進行序列分析，根據(jù)其N和G基因的核苷酸同源性及建立的遺傳進化樹，可將云南毒株分為2個進化分支，其中YNTC06單獨屬于第Ⅲ分支，其余云南毒株均分布在分支Ⅰ上，且進一步分為3個小的亞分支。廣西狂犬病分離毒株屬劃分為3個分支，不同分支毒株間N基因核酸序列同源性小于90%，同一分支毒株間核酸序列同源性大于96%［10］，與云南2個分支毒株分析結(jié)果一致。

根據(jù)推導(dǎo)的N、G蛋白氨基酸序列，對N基因和G基因的主要抗原位點分析表明，這兩個基因上的抗原位點都有變異發(fā)生，YNTC06毒株在NP抗原區(qū)Ⅳ的360、369、375、379位存在變異，其余云南毒株在371、375、379位存在差異。除YNTC06在抗原區(qū)Ⅰ的360位發(fā)生變異外，其余基因Ⅰ型毒株抗原區(qū)Ⅰ未發(fā)生變異。除YNTC06毒株在375位（T－M）磷酸化位點存在變異外，其余毒株在389、375位的2個磷酸化位點都未變異。YNNJ08在394（Y→C）、YNZT07在397（G→S）、416（L→P）位T細胞表位發(fā)生變異。YNTC06在369（Y→H）、375（T→M）、379（L→V）位B細胞表位發(fā)生變異。

YNTC06毒株在GP抗原區(qū)Ⅰ未發(fā)生變異，抗原區(qū)Ⅱ的39位（S→P）及Ⅲ的355位（V→A）存在變異。其余云南毒株抗原區(qū)Ⅰ及Ⅱ的關(guān)鍵性位點未發(fā)生變異，抗原區(qū)Ⅲ的332位氨基酸為異亮氨酸（I），而通常此位點為纈氨酸（V），其它位點未發(fā)生變異。YNTC06的39位氨基酸由絲氨酸（S）突變?yōu)楦彼幔≒），導(dǎo)致37位糖基化位點消失，僅存在一個糖基化位點（319位）外，其余云南毒株都是有37位和319位兩個糖基化位點。云南毒株在GP330、333位毒力位點未發(fā)生變異，均為強毒株。

本次所測的10株云南狂犬病毒基因結(jié)構(gòu)及變異、亞組群劃分與地理位置無相關(guān)性，如在分支Ⅰ中的3個亞分支上，第二亞分支的紅河毒株（HH10）和昭通毒株（ZT07）分別位于滇東南和滇東北，第三亞分支的怒江毒株（NJ08）、曲靖毒株（QJ08、QJ09）、昭通毒株（ZT09）、紅河毒株（H H09）、昆明毒株（KM10）分別位于滇西北、滇東、滇東北、滇東南、和滇中，且同一地點不同年份毒株卻不在一個亞分支上（YNZT07和YNZT09），說明云南狂犬病毒變異頻繁，起源復(fù)雜，這可能與云南省所處特殊地理位置有關(guān)，因為云南省與東南亞發(fā)展中國家緬甸、越南、老撾接壤，鄰近泰國、柬埔寨、印度等，邊民貿(mào)易往來頻繁，境外動物自由出入。

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Molecular characteristics of N and G genes of rabies virus from Yunnan Province during 2006 to 2010

ZHANG Wen－dong，ZHAO Huan－yun，LU Yue，CHENG Wan－ming，YUE Liang，ZHANG Ying－guo，ZHANG Fu－qiang
（Centre for Animal Disease Control and Prevention，Kunming 650001，China）

In order to understand the current prevalence of rabies and the molecular characteristics of rabies virus N and G genes in isolates found in Yunnan Province，the N and G genes of 10 street strains isolated from different regions of Yunnan Province from 2006 to 2010 were sequenced and these sequencing data were used to alignment and phylogenetic analysis with known representative strains．The phylogenic analysis showed that the nucleotide homologies of N and G genes of Yunnan strains with genotypeⅡ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ andⅦrepresentative strains were 72．1%－78．5%，58．4%－71．0%，with other strains of genotypeⅠwere 85．2%－90．1%，and 82．7－99．6%，the nucleotide homologies were 89．3%－99．2%，and 86．0－99．6%among the Yunnan strains．All rabies virus strains isolates from Yunnan belonged to genotypeⅠand could be divided into 2 groups，besides YNTC06 belonged to groupⅢ，the other Yunnan strains belonged to groupⅠand divided into 3 subgroups more．Genetic analysis showed that there are some specific mutations of amino acid on nucleoprotein and glycoprotein of Yunnan strains，The amino acid mutations of YNTC06 strain at 360、369、375 et al NP antigenic site，there were no mutation at GP330、333 of Yunnan strains，all of them are strong virus．The gene structure、mutations and subgroup divided of Yunnan rabies virus strains have no relationship with the geographical location．

Rabies virus；Nucleoprotein gene；Glycoprotein gene；Molecular characteristic

1．云南省動物疫病預(yù)防控制中心，昆明 650051；2．成都軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心，昆明 650032

R373．9

A

1002－2694（2011）10－0871－06

＊國家農(nóng)業(yè)公益性行業(yè)科研專項（201103008），軍隊“十一五”科技攻關(guān)項目（08G034）

張富強，Email：zfq1968＠yahoo．com．cn

2010－11－12；

2011－15－18