楊寧 蔣立新

有研究表明膽脂瘤的病理機制可能是細胞增殖與凋亡失衡的過程，并與多種細胞因子異常表達有關(guān)[1]。本研究通過觀察凋亡抑制蛋白Livin及Survivin在膽脂瘤上皮的表達，探討其與膽脂瘤的關(guān)系以及兩者之間的相關(guān)性，從而進一步揭示中耳膽脂瘤的發(fā)病機制，為其治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1標本制備 選取符合納入標準的25例中耳膽脂瘤標本為實驗組，同時選取其中15例患者外耳道骨部正常皮膚組織為對照組。標本取出后，立即用10%甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)切片備用。

1.2檢測試劑 Livin兔抗人多克隆抗體(即用型)購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，Survivin兔抗人多克隆抗體(即用型)、PV-9000二步法免疫組化檢測試劑盒、末端轉(zhuǎn)移酶介導的原位缺口末端標記染色(TUNEL)凋亡細胞檢測試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3檢測方法

1.3.1PV-9000二步法免疫組織化學檢測 標本經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化,3%過氧化氫溶液孵育10分鐘, 蒸餾水洗滌5分鐘2次，磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH 7.3±0.1) 洗滌5分鐘3次。微波爐抗原修復15 分鐘(溫度94～98 ℃), 蒸餾水洗滌5分鐘2次,PBS洗滌5分鐘3次。滴加一抗即用型Livin兔抗人多克隆抗體、Survivin兔抗人多克隆抗體，37 ℃濕盒孵育2小時，PBS沖洗3分鐘3次。滴加二抗辣根酶標記羊抗兔/小鼠IgG多聚體，37 ℃濕盒孵育20分鐘，PBS沖洗3分鐘3次。加適當比例的DAB顯色劑，顯微鏡下觀察，顯色3～5分鐘，出現(xiàn)棕黃色顆粒后，以自來水充分沖洗終止顯色,蘇木素復染。梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。用PBS溶液替代一抗作陰性對照，用已知的陽性片作陽性對照。

1.3.2TUNEL凋亡細胞的檢測 切片常規(guī)脫蠟，充分水化后用新鮮配制的3%過氧化氫溶液孵育10 min,蒸餾水洗滌2分鐘3次。標本片加0.01 M TBS(氯化鈉8.5 g、Tris 1.2 g、純乙酸0.5 ml、蒸餾水加至1 000 ml) 1：200新鮮稀釋Proteinase K 37 ℃消化10分鐘，0.01 M TBS 洗滌2分鐘3次。標本片加標記緩沖液20微升/片，以保持切片濕潤。每張切片取TdT和 DIG-UTP各1 μl，加入18 μl標記緩沖液中，混勻。甩去切片上多余液體后加標記液，20微升/片。置樣品于濕盒中，37 ℃反應(yīng)2小時。0.01 M TBS 洗滌2分鐘3次。加封閉液50微升/片，室溫孵育30分鐘，甩掉封閉液，不洗。用抗體稀釋液1：100稀釋生物素化抗地高辛抗體(取1 ml抗體稀釋液加生物素化抗地高辛抗體10 μl)，混勻后50微升/片加至標本上。置樣品于濕盒中，37 ℃反應(yīng)30分鐘,0.01 M TBS洗滌2分鐘3次。用抗體稀釋液1：100稀釋SABC：取1 ml抗體稀釋液加SABC 10 μl，混勻后50微升/片加至切片,37 ℃反應(yīng)30分鐘,0.01 M TBS洗滌5分鐘4次。DAB顯色,水洗,蘇木素輕度復染,脫水，透明，封片,顯微鏡觀察。整個操作參照TUNEL凋亡細胞檢測試劑盒說明書進行,以TBS代替末端標記液作陰性對照，已知TUNEL陽性片作陽性對照。

1.4結(jié)果判定 顯微鏡下觀察Livin及Survivin以細胞核或細胞漿著棕黃色者為表達陽性細胞。評分方法：著色范圍以陽性細胞所占的平均百分數(shù)記分:無著色為0，小于20%為1，21%～50%為2，大于50%為3；著色強度依據(jù)深淺記分：無著色為0，淺著色為1，深著色為2。上述兩項相加為著色程度積分：結(jié)果是0、1為陰性(-)，2為弱陽性(+)，3為陽性(++)，大于等于4為強陽性(+++)。

凋亡判定：凋亡細胞陽性結(jié)果表現(xiàn)為棕黃色核、核固縮、核形狀不規(guī)則，細胞核染色質(zhì)濃縮、邊聚，附著于核膜內(nèi)表面，并形成新月形或環(huán)狀,核碎裂。細胞凋亡程度以凋亡指數(shù)(apoptotic index,AI)表示。隨機選取高倍視野,觀察計數(shù)1 000個細胞，計算陽性細胞百分率，AI=陽性細胞數(shù)/觀察細胞數(shù)×100%。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料用陽性例數(shù)和陽性率來表示，膽脂瘤上皮和膽脂瘤患者外耳道上皮之間表達陽性率的比較用四格表χ2檢驗，凋亡指數(shù)(AI)的比較采用t檢驗，相關(guān)分析采用Spearman等級相關(guān)檢驗，一致性檢驗采用Kappa分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1Livin在膽脂瘤上皮中的表達 Livin在正常外耳道皮膚主要分布在基底層細胞的細胞質(zhì)中(圖1)，陽性9例，占60.0%。Livin在膽脂瘤上皮中不表達或低表達(圖2)，陽性表達為5例，占20.0%，4例呈(+)，1例呈(++)，與正常皮膚組織陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.593，P=0.010)，膽脂瘤上皮中的Livin蛋白表達明顯下調(diào)(表1)。

表1 實驗組和對照組Livin蛋白的表達(例)

注:* 與對照組比較，χ2=6.593，P<0.05

2.2Survivin在中耳膽脂瘤上皮中的表達 15例正常外耳道皮膚標本中10例可見到Survivin蛋白的陽性表達(圖3)，25例膽脂瘤標本中有7例Survivin陽性表達，著色于膽脂瘤上皮的基底層和基底上層細胞的細胞核和/或細胞質(zhì)(圖4)。陰性對照膽脂瘤上皮未見Survivin蛋白表達。兩組陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.736，P=0.017)，Survivin在膽脂瘤上皮的表達明顯下調(diào)(表2)。

表2 實驗組和對照組Survivin蛋白的表達(例)

注:* 與對照組比較，χ2=5.736，P<0.05

2.3中耳膽脂瘤組織中Survivin 和Livin蛋白表達的相關(guān)性(表3)

表3 中耳膽脂瘤組織中Survivin和Livin蛋白表達的相關(guān)性(例)

經(jīng)Spearman等級相關(guān)檢驗，r=0.749，P=0.000，Kappa值為0.688，P=0.000，兩因子呈正相關(guān)，一致性較好，說明它們可能起協(xié)同作用。

2.4凋亡細胞檢測 全部標本都存在凋亡細胞，但陽性細胞數(shù)量及分布部位不同。在正常外耳道皮膚中，凋亡細胞散在分布于上皮各層中，數(shù)量較少(圖5)，AI均值為 3.20%±0.90%；膽脂瘤上皮中，凋亡細胞分布于顆粒層和棘層(圖6)，AI值明顯升高，平均為43.80%±12.60%，兩組差異有顯著統(tǒng)計學意義(t=2.797，P=0.01)。

圖1 Livin在外耳道皮膚的陽性表達(二步法×200)圖2 Livin在膽脂瘤上皮的陰性表達(二步法×200) 圖3 Survivin在外耳道皮膚的陽性表達(二步法×200)

2.5膽脂瘤組織中凋亡抑制蛋白的表達與細胞凋亡的關(guān)系 膽脂瘤組織中凋亡抑制蛋白Livin、Survivin表達陰性組AI值明顯升高，分別為82.50%±8.30%和75.20%±10.70%，Livin、Survivin表達陽性組AI值較低，分別為21.70%±2.60%和35.50%±6.70%，經(jīng)Spearman 等級相關(guān)檢驗，兩者呈負相關(guān)。

3 討論

中耳膽脂瘤的特點是上皮細胞有高度增殖能力，但細胞增殖旺盛的同時，細胞的凋亡也加速[1]。Sasaki等[2]認為膽脂瘤屬于局部增殖性疾病。 Bujia等[3]比較膽脂瘤上皮和外耳道上皮的增殖細胞核抗原(proliforating cell nuclear antigen,PCNA)的表達差異，膽脂瘤上皮各層細胞都有PCNA的表達，說明膽脂瘤上皮細胞有潛在的分裂增殖能力。Park等[4]用TUNEL法、免疫印跡和免疫組織化學法檢測發(fā)現(xiàn)，與凋亡相關(guān)的Fas/APO-1蛋白在膽脂瘤上皮棘層和顆粒層細胞中表達增強；Kojima等[5]用原位雜交和免疫組織化學法分別檢測凋亡細胞和PCNA，發(fā)現(xiàn)膽脂瘤上皮各層細胞均有PCNA表達，提示膽脂瘤上皮具有高度增生和凋亡的雙重特性。

TUNEL技術(shù)在保持組織細胞形態(tài)的基礎(chǔ)上觀察凋亡細胞的分布，其特異性和敏感性都很高。本研究發(fā)現(xiàn)，在正常外耳道皮膚中，凋亡細胞散在分布于上皮各層中，數(shù)量較少；而在膽脂瘤上皮中，凋亡細胞分布于顆粒層和棘層，數(shù)量較多，顯著高于正常外耳道上皮組織，證實膽脂瘤上皮細胞中確實存在凋亡增強。在正常鱗狀上皮中，只有基底層的細胞具有分裂能力，隨后細胞離開此層向上皮表面遷移，當細胞到達顆粒層的時候，進入破壞期，失去細胞器，最終胞漿內(nèi)只殘余角蛋白絲，這是正常鱗狀上皮的凋亡過程[6]。因而凋亡細胞應(yīng)表達在顆粒層，膽脂瘤上皮凋亡細胞不僅出現(xiàn)在顆粒層，而且出現(xiàn)在棘層，表明膽脂瘤上皮棘層細胞即開始了凋亡過程，這可能是膽脂瘤上皮細胞凋亡增強的組織學基礎(chǔ)。這種膽脂瘤上皮的棘層細胞中一部分細胞仍具有分裂能力、另一部分細胞則開始了凋亡過程的現(xiàn)象，說明膽脂瘤上皮細胞增殖和凋亡發(fā)生了紊亂，即上皮過度增殖產(chǎn)生了大量細胞，同時又發(fā)生相應(yīng)的凋亡增強，周而復始，促進了膽脂瘤角蛋白碎屑堆積，使膽脂瘤不斷增大[7]。

Livin是近年來發(fā)現(xiàn)的人類凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族的新成員，最初從人類胚腎cDNA克隆得到，稱為K IAP(kidney inhibitor of apoptosis protein)[8]。由于該基因在黑色素瘤細胞中高度表達，也叫做ML IAP(melanoma inhibitor of apoptosis protein)[8]。Livin蛋白N端包含一個BIR結(jié)構(gòu)，C端含有一個RING環(huán)指結(jié)構(gòu)，抗凋亡的主要結(jié)構(gòu)為BIR。Livin在正常成人大多數(shù)終末分化組織中低表達或不表達，但在黑色素瘤、肺癌、胃腸癌、膀胱癌、乳腺癌等多種人類腫瘤中表達[8～12]。最近研究表明，Livin可以抑制內(nèi)源性和外源性兩條途徑誘導的細胞凋亡。另外，Livin還可以直接抑制Caspase而實現(xiàn)抗細胞凋亡。Livin通過兩個亞基的BIR序列與Caspase-3、6、7、8、9、10結(jié)合而發(fā)揮抗細胞凋亡作用。越來越多的研究表明，Livin在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要的作用[8～12]。已有實驗表明，Livin能夠抑制多種刺激(包括抗癌藥)誘導的腫瘤細胞的凋亡，并與腫瘤細胞的耐藥性有關(guān)[13]。Survivin也是IAP家庭成員之一。最近Park[14]等研究證實在膽脂瘤上皮中可以檢測到P63與Survivin蛋白的表達，且Survivin蛋白的表達與細胞凋亡呈負相關(guān)，Huisma[15]的研究也證實了這一點。本研究檢測到Livin在膽脂瘤上皮中不表達或低表達，陽性表達率顯著低于正常外耳道皮膚，說明膽脂瘤中的Livin蛋白表達明顯下調(diào)；膽脂瘤標本中Survivin蛋白的陽性表達率也低于正常外耳道皮膚，說明Survivin在膽脂瘤上皮的表達也明顯下調(diào)。

Survivin和Livin同屬于IAP家族成員，均可直接作用于Caspase-3和Caspase-7，實現(xiàn)抗細胞凋亡作用，但是二者在抗凋亡功能上并非完全一樣，它們之間是否存在相關(guān)性，目前報道甚少。本研究采用Spearman等級相關(guān)檢驗得出，兩因子呈正相關(guān)，一致性較好，說明它們可能在膽脂瘤的發(fā)生、發(fā)展中起協(xié)同作用。膽脂瘤組織中凋亡抑制蛋白Livin、Survivin表達陰性組，AI值明顯升高，Livin、Survivin表達陽性組AI值較低，經(jīng)Spearman等級相關(guān)檢驗兩者呈負相關(guān)，即凋亡抑制蛋白表達越高，細胞凋亡越少；凋亡抑制蛋白表達越低，細胞凋亡越多。

本研究檢測了Survivin、Livin在正常外耳道皮膚與中耳膽脂瘤組織中的表達情況，并探討了二者與膽脂瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系以及二者表達的相關(guān)性，進一步證明膽脂瘤上皮存在過度凋亡，為進一步揭示中耳膽脂瘤的發(fā)病機理提供了實驗依據(jù)，同時為它的靶向治療提供了新的途徑。

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