賈學斌 李興啟 張瀛 朱耀國

Ca2+在體內有非常廣泛的生理作用[1～3]，Ca2+參與耳蝸聲機械-電轉換、內耳聲感受的頻率選擇及基底膜振動的非對稱性等過程。維持細胞內Ca2+平衡是發(fā)揮正常耳蝸功能的保證。細胞內Ca2+穩(wěn)態(tài)的調節(jié)機制主要包括兩方面，即增加胞漿內Ca2+濃度和減少胞漿內Ca2+濃度。增加胞漿內Ca2+濃度途徑有：細胞膜上的Ca2+通道開放、Na+/ Ca2+交換、Ca2+/H+交換及Ca2+被動擴散入胞等；而減少胞漿內Ca2+濃度的方式主要有Ca2+-ATP酶將Ca2+泵出細胞或泵入Ca2+庫和Na+/ Ca2+交換。若Ca2+-ATP酶的功能被抑制必將引起胞漿內Ca2+超載，可導致細胞損傷甚至死亡。L-精氨酸被認為是合成NO的底物，它可在一氧化氮合酶(NOS)及黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、黃素腺嘌呤單核苷酸(FMN)、四氫生物喋呤(BH4)、還原型尼克酰胺嘌呤二核苷酸(NADPH)等轉氫、轉電子體的協(xié)同作用下生成NO和L-胍氨酸。由此，L-精氨酸激活NO/cGMP通路，產生cGMP，進而激活磷酸激酶cGK-1對功能酶磷酸化。L-精氨酸激活NO/cGMP通路使磷酸激酶cGK-1活化后，可對多種蛋白質進行磷酸化，其中，對細胞內磷脂酶C的磷酸化將減少磷酸肌醇IP3的含量，進而起到降低胞內Ca2+濃度的作用，從而調節(jié)細胞胞漿內Ca2+的平衡。

在耳蝸中存在著NO/cGMP通路的各關鍵酶及Ca2+ATP酶。本實驗用Ca2+-ATP酶抑制劑造模，使胞內Ca2+超載，然后加入L-精氨酸以激活NO/cGMP通路，觀察耳蝸中L-精氨酸是否對Ca2+-ATP酶抑制劑有一定的拮抗作用。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器 基礎液：人工外淋巴液(APL)(mM)：NaCl 137，KCl 5，CaCl2，NaH2PO41，Glucose 11，NaHCO312，MgCl21，用前將pH調至7.2～7.4，用全自動冰點滲透壓儀調節(jié)滲透壓到300±2 mOsm/L。實驗試劑：L-精氨酸、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)、 Ca2+-ATP酶抑制劑(Cyclopiazonic acid)、一氧化氮合酶(NOS)抑制劑L-NNA、亞甲基藍(Methylene blue)。

微量注射泵WZS-50F， STORZ冷光源， OLYMPUS解剖顯微鏡，數(shù)字溫度計，微操縱器，電屏蔽實驗臺，動物人工呼吸機， TDT系統(tǒng)自制聲控裝置，ER-10C型耳塞式耳機。

1.2實驗動物及分組 選用耳廓反射靈敏、體重250～350 g的健康雜色豚鼠70只，雌雄不限，隨機分為7組，每組10只：①人工外淋巴液組；②Ca2+-ATP酶抑制劑組；③L-精氨酸組；④Ca2+-ATP酶抑制劑+ L-精氨酸組；⑤Ca2+-ATP酶抑制劑+環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)組；⑥Ca2+-ATP酶抑制劑+ L-精氨酸+ 非選擇性一氧化氮合酶(NOS)抑制劑組；⑦Ca2+-ATP酶抑制劑+ L-精氨酸+可溶性環(huán)磷酸鳥苷合酶抑制劑(sGC抑制劑)組。所有動物均無耳毒性藥物使用史及中耳炎病史，在無噪聲環(huán)境下飼養(yǎng)3～5天后進行實驗。所有動物均以右耳為實驗耳。

1.3全耳蝸灌流方法 各組動物分別全耳蝸灌流以上各藥物120分鐘。用5%異戊巴比妥鈉(100mg/kg)經腹腔注射麻醉后，固定于電屏蔽的操作臺(美國TMC公司)，用數(shù)字式溫度計監(jiān)測體溫，熱水袋保持動物體溫在37～39.2℃之間。行氣管切開，插入氣管插管行人工呼吸，呼吸頻率為60次/分，潮氣量3毫升/次。腹腔注射氯化琥珀膽堿(15 mg/kg),消除肌電干擾。皮下注射阿托品(15 mg/kg)，減少分泌物，保持呼吸道通暢。經腹側暴露右側聽泡。打開聽泡后，在解剖顯微鏡下用自制尖針分別在耳蝸底回鼓階和前庭階的骨壁各鉆一小孔(直徑約0.2 mm)。在解剖顯微鏡下將拉制好的玻璃微管(尖端直徑約50 μm)經微操縱器插入鼓階適宜深度，并用醫(yī)用粘膠封填小孔周圍，避免滲漏。試劑從鼓階入，前庭階出，全耳蝸灌流速度為2 μl/min。每只動物行全耳蝸灌流2小時。各組中的部分動物在實驗結束時換作鎂藍灌流，清楚顯示藍色液體由底回鼓階進入，即刻出現(xiàn)蝸尖處藍染，最后藍色液體從另一孔前庭階流出，各回耳蝸均被染成藍色，說明該灌流過程中試劑到達蝸頂，該灌流方法確實可靠。

1.4耳蝸聽神經復合動作電位(CAP)和微音器電位(CM)的記錄 記錄銀制電極置于圓窗龕，參考電極置于頸部肌肉，地線接鼻。短聲誘發(fā)的CAP放大后信號由TDT信號處理儀處理，CAP波形顯示于計算機。選擇短純音(1 kHz，10～100 dB SPL，每5 dB一檔，上升/下降時間為2 ms，平臺期20 ms)誘發(fā)CM(選擇1 kHz)，記錄100～70 dB的幅度，以100 dB SPL刺激聲強度的幅值為100%，其余刺激聲強度的CM幅值取其與100 dB SPL刺激聲幅值的比值(%)。各組動物耳蝸打孔前后記錄及灌流過程中每隔30分鐘記錄一次CAP閾值、CM幅度，連續(xù)記錄 2小時。

1.5統(tǒng)計學方法 采用Stata統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，兩兩比較。

2 結果

2.1各組灌流藥物對CAP閾值的影響 灌流L-精氨酸組與灌流人工外淋巴液組CAP閾移比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而灌流Ca2+-ATP酶抑制劑組相對于人工外淋巴液組CAP閾移26 dB，兩者比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；灌流Ca2+-ATP酶抑制劑+ L-精氨酸組的CAP閾值比灌流Ca2+-ATP酶抑制劑組改善9 dB，兩者間差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而Ca2+-ATP酶抑制劑+ L-精氨酸組與灌流Ca2+-ATP酶抑制劑+cGMP組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；在Ca2+-ATP酶抑制劑+ L-精氨酸基礎上加入非選擇性NOS抑制劑則使閾值提高了10 dB，兩者比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；加NOS抑制劑組與加sGC抑制劑組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表1)。

2.2各組灌流藥物對CM相對幅度的影響 100 dB SPL 1 kHz和70 dB SPL 1 kHz CM相對幅度變化不大。其中，灌流L-精氨酸組與灌流人工外淋巴液組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而灌流Ca2+-ATP酶抑制劑組相對于人工外淋巴組CM相對幅度下降了大約68%，兩者比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；灌流Ca2+-ATP酶抑制劑+ L-精氨酸組的CM相對幅度比灌流Ca2+-ATP酶抑制劑組提高了大約25%，兩者間差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而Ca2+-ATP酶抑制劑+ L-精氨酸組與灌流Ca2+-ATP酶抑制劑+cGMP組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；在Ca2+-ATP酶抑制劑+ L-精氨酸基礎上加入非選擇性NOS抑制劑則使CM相對幅度下降了大約22%，兩者比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01);加NOS抑制劑組與加sGC抑制劑組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表1)。

表1 各組灌流藥物前后的CAP閾移(dB)及1 kHz短純音100、70 dB SPL的CM相對幅度

3 討論

Ca2+作為第二信使參與了機體眾多的生理活動，如分泌、運動、能量代謝、細胞分裂、蛋白合成、膜通透性和離子轉運等[1～3]。在耳蝸中，Ca2+與毛細胞功能的維持、機械-電轉換、外毛細胞的主動收縮反應、內耳聲感受的頻率選擇、基底膜振動的非對稱性及非線性響應、毛細胞適應性以及傳出神經對內耳的調控等關系密切[4，5]，而維持細胞內的Ca2+濃度相對平衡是完成這些生理功能的基礎。

Ca2+-ATP酶作為排出Ca2+的主要方式已受到越來越多的關注。Ca2+-ATP酶廣泛存在于真核細胞中，它對細胞內Ca2+的調節(jié)是一種主動的離子轉運過程，每轉運一個Ca2+要消耗1～2個ATP。Ca2+-ATP酶與Ca2+有較高的親和性，可在靜息細胞內Ca2+濃度很低的情況下不斷將Ca2+排出細胞或泵入胞內鈣庫，持續(xù)的發(fā)揮對細胞內Ca2+濃度的調節(jié)作用[1]，故Ca2+-ATP酶的作用是保持相對穩(wěn)定的細胞內低Ca2+。Ca2+-ATP酶分布于耳蝸中的內外毛細胞、支持細胞(如Deiters’細胞、Hensen’s細胞及柱狀細胞)、血管紋的細胞、螺旋神經節(jié)細胞及耳蝸的傳出傳入神經纖維[6～12]。當Ca2+-ATP酶被抑制時，造成胞內Ca2+超載，對耳蝸功能的影響表現(xiàn)為耳蝸微音器電位(CM)幅度下降，耳蝸聽神經復合動作電位(CAP)閾值提高及耳蝸內電位(EP)下降[7，13～16]。本研究結果與文獻相似，可見，Ca2+-ATP酶抑制劑可使CAP閾值提高，CM相對幅度下降及非線性特性減弱。一方面是由于Ca2+超載可抑制鈣庫動員，使內外毛細胞、傳出傳入神經纖維、螺旋神經節(jié)細胞及血管紋中參與形成EP的細胞功能受到抑制；另一方面，由于Ca2+超載使供應耳蝸的血管發(fā)生痙攣，造成耳蝸細胞能量供應減少，其功能也必將受到抑制。

本實驗中，在Ca2+-ATP酶抑制劑的基礎上加入L-精氨酸可緩解前者對CAP閾值及CM相對幅度的影響，而加入非選擇性NOS抑制劑后則L-精氨酸的作用被減弱。且加入NOS抑制劑和sGC抑制劑后對CAP閾移和CM相對幅度具有同樣的作用，提示L-精氨酸在NOS作用下有改善耳蝸功能的作用，且可被非選擇性NOS抑制劑和sGC抑制劑抑制。其可能的機制是：L-精氨酸是合成NO的底物，它可以活化NO/cGMP通路產生cGMP，后者可激活cGK-1，活化的cGK-1通過磷酸化過程調節(jié)各功能酶的活性，從而起到調節(jié)細胞功能的作用。因Ca2+-ATP酶抑制劑使胞內Ca2+濃度升高途徑是抑制Ca2+向胞外排出和減少胞內鈣庫攝取Ca2+，故推測L-精氨酸對Ca2+-ATP酶抑制劑的拮抗作用是通過抑制細胞內磷脂酶C的活性，降低了磷酸肌醇IP3的含量，從而使胞內鈣庫減少Ca2+的釋放，或者改善被Ca2+-ATP酶抑制劑抑制的Ca2+-ATP酶的活性，使向胞外排出的Ca2+及由鈣庫攝取的Ca2+都增多[17,18]。

本研究結果說明，Ca2+-ATP酶及NO/cGMP通路在調節(jié)細胞Ca2+平衡方面有著非常重要的作用，但其具體的作用機制尚待進一步的研究。

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