陳鑫 邱建華

噪聲對聽力的影響歷來受到關(guān)注，但目前尚無有效的治療手段。葛根是一種常見的中草藥，其主要活性成分葛根素為異黃酮物質(zhì)，因具有改善微循環(huán)、清除自由基等作用已廣泛應用于臨床，包括心腦血管疾病以及突發(fā)性聾的治療。本實驗旨在探討葛根素對噪聲性聾的防治作用。

1 材料與方法

1.1材料 健康(耳廓反射正常)雄性白化豚鼠18只，體重300～350 g，由第四軍醫(yī)大學動物實驗中心提供。主要試劑：葛根素注射液(陜西安康正大制藥有限公司，2 ml:0.1克/支)，抗硝基酪氨酸兔多克隆抗體(CHEMICON公司)，即用型SABC試劑盒(武漢博士德公司)，DAB顯色試劑盒(中杉金橋公司),鬼筆環(huán)肽(Sigma公司)。主要儀器：SS-1型聲刺激器，2×50 W功率放大器，AZ8928型噪聲分析儀，ABR檢測儀(美國Bio-logic SYSTEMS CORP)，正置熒光顯微鏡(OLYMPUS BX51)，冰凍切片機(LEICA CM1850)。

1.2方法

1.2.1動物分組及處理 18只雄性豚鼠隨機分為空白對照組、單純噪聲組、噪聲+葛根素組，每組6只。造模期間每只動物都安置在特別定制的小隔中，各處噪聲強度差別不大于3 dB。在實驗期間動物可以自由攝取食物與水，環(huán)境噪聲40±5 dB(A)。正常對照組不予噪聲處理，并于每日上午8～10點腹腔注射生理鹽水2 ml，持續(xù)10日。單純噪聲暴露組每日上午8～10點腹腔注射生理鹽水2 ml，持續(xù)10日，并于實驗第3天中午12點開始給予噪聲暴露。噪聲加葛根素組每日上午8～10點腹腔注射葛根素注射液(150 mg/kg)，持續(xù)10日，同樣于實驗第3天中午12點給予噪聲暴露。噪聲發(fā)生系統(tǒng)由SS-1型聲刺激器和2×50 W功率放大器兩部分組成。試驗動物置于噪聲接收籠內(nèi)，揚聲器位于噪聲接收籠頂部，用AZ8928型噪聲分析儀監(jiān)測籠內(nèi)聲強級。每只動物給一次噪聲刺激，噪聲為4 kHz純音，強度128 dB SPL，時間為6小時，分別于實驗第1、4、7、10天對各組豚鼠進行ABR檢測。在第10天給藥結(jié)束后，每組中分別隨機抽取2只進行基底膜鋪片染色、2只進行冰凍切片的制備及免疫組化染色。剩余動物正常飼養(yǎng)，不予其它處理，以備補充實驗。

1.2.2ABR測試 ABR檢測儀器為Bio-logic SYSTEMS CORP(美國)。動物常規(guī)麻醉(腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg)。針型記錄電極置于前額正中皮下，參考電極置于測試耳后皮下，接地電極置于鼻尖，刺激聲為極性交替短聲(alternating click)，由TDH49耳機輸出，耳機距動物外耳道口1 cm。參數(shù)設(shè)置：刺激率13次/秒，濾波帶寬100～3 000 Hz，疊加1 024次。從90 dB SPL開始觀測，按照5 dB的降序依次進行檢測，以波Ⅲ出現(xiàn)的最小刺激強度為該動物的ABR反應閾。依次檢測每只動物左右耳。

1.2.3基底膜鋪片染色 動物經(jīng)心臟灌注固定(4%多聚甲醛)后，在解剖顯微鏡下打開聽泡，蝸尖挑一小孔，去除鐙骨，打開圓窗、卵圓窗，用玻璃吸管從蝸尖和圓窗各處灌注固定，4%多聚甲醛過夜。次日，在解剖顯微鏡下小心去除耳蝸骨壁，去除螺旋韌帶、血管紋，撕去前庭膜，游離各回基底膜，將基底膜置于玻片之上，滴加鬼筆環(huán)肽(1:60)，避光染色20分鐘。0.01 mol PBS(pH=7.2)緩沖液沖洗3次，基底膜鋪片，吸干水分，80%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察照相。在毛細胞缺失損傷最嚴重的部位，放大600倍，連續(xù)抽取3個視野計算毛細胞缺失率，取其平均值，如遇視野周邊出現(xiàn)不完整的細胞，只記一邊，即計左不計右，計上不計下。

1.2.4冰凍切片的制備 心臟灌注4%多聚甲醛后，在解剖顯微鏡下打開聽泡，4%多聚甲醛過夜。10%EDTA室溫下脫鈣兩周，30%蔗糖脫水過夜。10%明膠定向包埋。待明膠完全凝固后，將標本置于凍臺，與蝸軸平行平面定位，Lecia恒冷箱切片機連續(xù)切片，厚度為10 μm。

1.2.5免疫組織化學染色(ABC法) 制備好的各組織切片晾干后，用0.3%過氧化氫甲醛封閉內(nèi)源性過氧化物酶，室溫30 min；5%BSA山羊血清封閉液室溫30 min；抗硝基酪氨酸抗體(1:300)，4 ℃冰箱過夜；生物素羊抗兔IgG室溫30 min；SABC室溫30 min；DAB顯色后蘇木精復染。以上步驟中間以0.01 mol/L PBS(pH=7.2)緩沖液沖洗3次，每次10分鐘。陰性對照用0.01 mol/L PBS替代第一抗體，其余步驟相同。切片依次脫水、透明、封片。胞核染色呈棕黃色為硝基自由基表達陽性，胞核無著色為陰性，根據(jù)棕黃色深淺度定性其表達的強弱。

1.3統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)用 SPSS17.0統(tǒng)計學軟件處理,各樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1ABR測試結(jié)果 各組豚鼠不同時間點的ABR反應閾見表1。

表1 各組豚鼠不同時間點的ABR反應閾

經(jīng)單因素方差分析顯示，各組豚鼠ABR反應閾在噪聲刺激前(實驗第1天)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；噪聲暴露后第1(實驗第4天)、4(實驗第7天)、7(實驗第10天)天，各組各時間點之間ABR反應閾比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，噪聲+葛根素組在噪聲暴露后第1、4、7天的反應閾均低于單純噪聲組(P值均為0.000,P<0.01)?？瞻讓φ战M各時間點的閾值差異無顯著統(tǒng)計學意義(P>0.05)；單純噪聲組第4、7、10天ABR反應閾明顯高于其暴露噪聲前閾值(P<0.01)，但噪聲暴露后各時間點之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；噪聲+葛根素組在噪聲暴露后各時間點閾值比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.2形態(tài)學觀察 各組耳蝸鋪片見圖1。噪聲暴露后損傷主要集中在第二回外毛細胞。單純噪聲組各排毛細胞缺失嚴重，總損失率約為72.65%；噪聲+葛根素組外毛細胞損傷較單純噪聲組輕，可見第1、2排毛細胞有所缺失，總損失率約為21.48%；空白對照組外毛細胞排列整齊，無明顯缺失。

2.3免疫組織化學法(硝基自由基檢測) 單純噪聲組基底膜、螺旋韌帶血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)多處出現(xiàn)深棕色著色，過氧化硝基產(chǎn)物生成明顯；噪聲+葛根素組基底膜、螺旋韌帶血管紋著色稍深，螺旋神經(jīng)節(jié)處著色較淺；空白對照組僅血管紋處稍有著色，其余各處未著色(圖2)。

圖1 三組豚鼠耳蝸鋪片

a為單純噪聲組耳蝸第二回，總損失率約為72.65%，各排外毛細胞缺失均較為嚴重。b為噪聲+葛根素組耳蝸第二回，可見第一、二外排毛細胞有所缺失，總損失率約為21.48%。c為空白對照組耳蝸第二回，可見外毛細胞排列整齊，無明顯缺失，缺失率約為0%。箭頭所示為外毛細胞缺失。(鬼筆環(huán)肽染色，各圖標尺均為100 μm )

圖2 三組豚鼠耳蝸免疫組化染色圖片

a單純噪聲組基底膜、螺旋韌帶血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)多處出現(xiàn)深棕色著色；b噪聲+葛根素組基底膜、螺旋韌帶血管紋著色稍深，螺旋神經(jīng)節(jié)處著色較淺；c空白對照組僅螺旋韌帶血管紋處稍有著色，其余各處未著色；d.陰性對照 (采用0.01 mol/L PBS替代第一抗體)。實心黑箭頭所指位置為基底膜，空心箭頭所指位置為螺旋韌帶血管紋，十字箭頭所示為螺旋神經(jīng)節(jié)。(DAB染色，標尺=100 μm)

3 討論

研究表明，連續(xù)過度的噪聲刺激將導致耳蝸內(nèi)、外毛細胞的損傷或丟失，造成暫時性聽覺閾移和永久性聽覺閾移。有文獻[1]認為噪聲性聾后7天聽力基本無大幅波動，而噪聲性聾的最佳治療窗口期為噪聲暴露后3天[2]，故本實驗根據(jù)目前常用噪聲暴露方式[1,3～5]，在動物噪聲暴露前后給予葛根素治療，并檢測實驗第1～10天ABR反應閾的變化。結(jié)果可見噪聲暴露前各組ABR反應閾差異并無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而在噪聲暴露后各組動物間ABR閾值差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，單純噪聲組動物ABR閾移達60 dB以上，說明噪聲暴露造模成功，動物聽力出現(xiàn)了暫時性閾移；噪聲+葛根素組較單純噪聲組聽力損失程度輕。本結(jié)果顯示葛根素治療組在噪聲后3天時暫時性閾移最小，這與Yoshimitsu等[5]試驗中第3天治療效果最好的結(jié)論一致。說明葛根素對于降低噪聲引起的動物暫時性閾移具有一定療效，并在噪聲暴露后第3天發(fā)揮了最大效用。

從文中形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)，4 kHz純音所造成的損傷多分布在豚鼠耳蝸第二回，與文獻報道相符[6]；單純噪聲組各排毛細胞缺失均較為嚴重，總損失率高達72.65%，而噪聲+葛根素組第3排外毛細胞纖毛倒伏但缺失并不明顯，第1、2排毛細胞存在部分缺失，總損失率約為21.48%，說明葛根素對噪聲暴露致耳蝸損傷有較明顯的保護作用。在強噪聲的刺激下，蓋膜與基底膜之間的剪切力過度增大，使毛細胞的纖毛發(fā)生過度的彎曲和偏轉(zhuǎn)，而因為耳蝸底回和第二回主要感知高頻聲音，基底膜位移幅度最大，因此此處毛細胞受損最為嚴重，纖毛大幅倒伏，毛細胞缺失比例最大。但葛根素治療能否減輕噪聲所帶來的機械損傷尚不明確。

目前噪聲性聾的機制并不明確，有學者[7]認為強噪聲引起過量自由基產(chǎn)生并引起內(nèi)耳血流量減少，產(chǎn)生過量自由基使細胞脂質(zhì)氧化產(chǎn)生異前列烷，進一步加劇血管收縮，引起局部缺血，缺血進一步產(chǎn)生更多的自由基，形成惡性循環(huán)。由于自由基產(chǎn)生時間極短，在檢測自由基的含量時，一般采取兩種方式，一種檢測脂質(zhì)氧化反應中所需酶的含量[8]，另一種就是檢測自由基終端產(chǎn)物。曾用于測量氧自由基含量的目的檢測因子包括丙二醛(MDA)[8]、異前列烷(8-Isoprostane)[9]、蛋白酶[10]、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)[8,11～13]。本實驗室之前也證實一氧化氮(NO)具有自由基性質(zhì)，極不穩(wěn)定，易與組織內(nèi)的O2-互相作用生成過氧亞硝酸根離子[14]。過氧亞硝酸根離子異常活躍，可能是危害性最大的自由基之一，其生成的眾多氧化或硝化產(chǎn)物都能反映過氧亞硝酸根離子(ONOO)-的活性，其中的3-硝基酪氨酸可以作為過氧亞硝酸根離子的標志物[15]。從本實驗免疫組化染色圖片中可見，單純噪聲組在毛細胞、螺旋韌帶血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)等部位都有強染色，說明在以上部位有大量強噪聲所引起的硝基自由基生成，而噪聲+葛根素組以上各處著色明顯減弱，螺旋神經(jīng)節(jié)處尤為突出。分析其原因可能為：暫時性閾移的產(chǎn)生可能與耳蝸內(nèi)環(huán)境的突然改變有關(guān)，強噪聲造成耳蝸機械性損傷的同時，毛細胞發(fā)放神經(jīng)沖動時的電信號以及神經(jīng)遞質(zhì)出現(xiàn)紊亂，內(nèi)耳血管痙攣，缺血缺氧，耳蝸內(nèi)出現(xiàn)大范圍脂質(zhì)過氧化反應。當耳蝸內(nèi)自由基產(chǎn)量不多，逐步被機體代謝清除后，聽力有可能得到恢復；但如果損傷因子過多，不論機械或是化學損傷，使得Corti器毛細胞發(fā)生了不可逆性的損傷，可能會形成永久性聽力閾移。在本實驗中，噪聲引起毛細胞出現(xiàn)了不同程度的缺失，這種暫時性閾移很有可能成為永久性閾移。而葛根素本身是一種異黃酮物質(zhì)，具有還原特性，可以優(yōu)先清除生成的自由基，避免自由基與細胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應，從而減輕噪聲帶來的細胞毒性。并且，葛根素具有改善微循環(huán)、改善血液流變學特性、抗血栓等作用[16]，最終使毛細胞損傷降低，機械能向生物電能的轉(zhuǎn)換效率較單純噪聲組高，因此葛根素組螺旋神經(jīng)節(jié)處受損程度較輕，且聽功能也有改善。

本實驗結(jié)果顯示，葛根素具有清除自由基、拮抗細胞毒性的作用，對提高噪聲性聾動物的聽功能有一定的作用，在噪聲暴露后第3日效果最佳。但與空白對照組比較還是具有顯著差異，不能完全保護毛細胞不受損傷，也不能完全逆轉(zhuǎn)或消除已經(jīng)出現(xiàn)的損傷。

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