王桂敏，韓鳳麗

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬一院中醫(yī)科，遼寧 錦 州 121001;2.內(nèi)蒙古莫旗人民醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼 倫貝爾 162850)

首烏延壽丹出自清·陸九芝《世補(bǔ)齋醫(yī)書(shū)》，原名延壽丹，由何首烏、菟絲子、杜仲、女貞子、桑椹、黑芝麻、旱蓮草、金櫻子、生地黃、牛膝、豨薟草、桑葉、忍冬藤13味中藥組成。方中何首烏、菟絲子、杜仲、女貞子、旱蓮草、桑椹、黑芝麻、金櫻子、生地黃補(bǔ)腎益精;牛膝、桑葉、忍冬藤、豨薟草活血通脈。諸藥相合共奏補(bǔ)腎活血之功，是延緩衰老之名方?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，本方能夠通過(guò)降脂、抗凝、改善血管內(nèi)皮功能等作用抑制AS的發(fā)生發(fā)展[1]。為了驗(yàn)證首烏延壽丹是否能通過(guò)其他途徑起到防治AS的作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)喂飼高脂飼料的方法，建立兔AS模型，應(yīng)用首烏延壽丹進(jìn)行干預(yù)治療，并觀察首烏延壽丹對(duì)AS血管PDGF-B、MMP-9表達(dá)的影響，以期為首烏延壽丹防治AS提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及飼料

健康日本大耳白兔32只，均為雄性，體重2kg～2.5kg，由遼寧醫(yī)學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物中心提供。高脂飼料:1%膽固醇，8%熟豬油和91%的普通飼料。

1.2 藥物、試劑、儀器

1.2.1 藥物 首烏延壽丹由遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一院中藥局提供，按照原方藥物用量(何首烏50g，豨薟草、菟絲子各15g，杜仲、懷牛膝、女貞子、旱蓮草、桑葉、黑芝麻、桑葚子、金櫻子各10g，金銀花、生地各5g)，在藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室研成粉末，存放在干燥通風(fēng)處備用。根據(jù)人體-家兔體表面積比值法換算家兔的每日用藥量[2]。辛伐他汀片(國(guó)藥準(zhǔn)字H20065119)由山東羅欣藥業(yè)生產(chǎn)。

1.2.2 試劑及儀器 兔抗人MMP-9多克隆抗體(上海太陽(yáng)生物有限公司)，兔抗鼠PDGF-B多克隆抗體(北京博奧森生物制劑有限公司)，CIAS-1000細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)(北京大恒圖像視覺(jué)有限公司)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(太倉(cāng)市醫(yī)療器械廠)。

1.3 分組與給藥[3]

日本大耳白兔單籠飼養(yǎng)，室溫20℃～22℃，相對(duì)濕度為50%～60%，經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始試驗(yàn)。遵循隨機(jī)原則，將動(dòng)物分成4組，每組8只。A組(空白對(duì)照組)，繼續(xù)喂飼普通飼料140g/d/只，B組(模型組)喂飼高脂飼料140g/d;C組(首烏延壽丹組)喂飼高脂飼料140g/d加首烏延壽丹1g/kg.d;D組(辛伐他汀組)喂飼高脂飼料140g/d加辛伐他汀2.5mg/kg.d[4]，喂養(yǎng)至第12周末。

1.4 取材與指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 取材 第12周末(實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí))，于清晨空腹從兔耳中動(dòng)脈采集血液5ml，注入不含抗凝劑的普通試管，靜置后離心分離血清。用全自動(dòng)生化儀測(cè)定總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、甘油三酯(TG)的水平。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于第12周末采用頸動(dòng)脈割傷法處死，迅速剖開(kāi)腹腔分離腹主動(dòng)脈，剝除外膜結(jié)締組織及脂肪，取約1cm長(zhǎng)動(dòng)脈血管沖凈，放入4%多聚甲醛溶液中固定，用于光鏡觀察病理形態(tài)學(xué)及免疫組化檢測(cè)。

1.4.2 指標(biāo)測(cè)定 將兔主動(dòng)脈標(biāo)本于4%中性甲醛溶液固定24h之后，自來(lái)水沖洗4h～6h，逐級(jí)脫水、透明、浸蠟、包埋制成臘塊，用石蠟切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片厚度5μm，于45℃溫水中展片，分別用普通玻片和多聚賴氨酸防脫玻片，撈片后置于56℃溫箱中干燥約2h～3h，用于HE和免疫組化染色。每一標(biāo)本取3張切片(普通玻片)作HE染色，每一標(biāo)本取3張切片(防脫玻片)作免疫組化染色，均按試劑盒步驟進(jìn)行操作。免疫組化以棕色反應(yīng)物為陽(yáng)性信號(hào)，細(xì)胞漿染色測(cè)定其平均灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，4組間比較采用單因素方差分析(ANVOA)，組間兩兩比較用LSD法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。病理形態(tài)學(xué)資料采用對(duì)比描述分析。

2 結(jié)果

2.1 各組兔血脂變化

表1顯示，第12周時(shí)，與正常對(duì)照組相比，模型組、首烏延壽丹組、辛伐他汀組TG、TC、LDL-C水平均顯著升高(P＜0.01，P＜0.05)，HDL-C顯著降低(P＜0.01);與模型組相比，首烏延壽丹組、辛伐他汀組TG、TC、LDL-C明顯降低(P＜0.05)，HDL-C明顯升高(P＜0.01)，首烏延壽丹組與辛伐他汀組TG、TC、LDL-C、HDL-C差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。

表1 各組兔血脂水平變化

表1 各組兔血脂水平變化

注:與正常組比較:*P＜0.05，△P＜0.01;與模型組比較:▲P＜0.05，#P＜0.01

組別 TC(mmol/L) TG(mmol/L) LDL-C(mmol/L) HDL-C(mmol/L)正 常 對(duì) 照 組1.64±0.74 0.72±0.25 0.61±0.26 0.52±0.18模 型 組 26.7±4.83* 6.00±1.43* 13.17±2.68* 3.66±0.57△中 藥 組 11.24±2.32＊▲ 1.65±0.65△▲ 3.89±1.58＊▲ 6.65±0.72△#辛 伐 他 汀 11.79±2.14＊▲ 2.04±0.73＊▲ 4.02±1.62＊▲ 6.48±0.61△#

2.2 各組血管內(nèi)膜病理形態(tài)學(xué)改變

HE染色顯示，正常對(duì)照組血管內(nèi)膜光滑、連續(xù)，內(nèi)皮細(xì)胞完整，排列整齊，內(nèi)彈力膜清晰完好，中膜由平滑肌細(xì)胞(SMC)組成，排列整齊，外彈力膜完整;模型組血管內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞絕大多數(shù)缺失，內(nèi)膜不均勻明顯增厚，內(nèi)膜中含有大量的泡沫細(xì)胞，內(nèi)有脂質(zhì)沉積，內(nèi)彈力膜消失，中膜SMC增殖，排列紊亂，外膜改變不明顯;首烏延壽丹組、辛伐他汀組內(nèi)膜輕度增厚，泡沫細(xì)胞少量，內(nèi)彈力膜尚清晰完整，中膜SMC排列尚整齊，外膜改變不明顯(見(jiàn)圖1)。

圖1 各組兔血管內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化(HE×200)

2.3 各組兔血管組織PDGF-B、MMP-9蛋白表達(dá)的改變

表2顯示，PDGF-B表達(dá)于細(xì)胞的胞漿中，正常對(duì)照組血管表達(dá)量低，呈淺棕黃色;模型組表達(dá)明顯增多，與正常對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.01);與模型組比較，首烏延壽丹組及辛伐他汀組表達(dá)明顯減輕(P＜0.01)，2用藥組PDGF-B表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表2 各組PDGF-B及MMP-9平均灰度值比較

表2 各組PDGF-B及MMP-9平均灰度值比較

注:與正常組比較:*P＜0.01;與模型組比較:▲P＜0.01

灰度值 正常組 模型組 中藥組 西藥組PDGF-B 21.34±6.66 145.41±13.28* 76.51±13.14＊▲ 73.03±10.58＊▲MMP-9 13.32±3.85 74.58± 6.78* 33.52±3.64＊▲ 32.72± 4.05＊▲

表2顯示，MMP-9表達(dá)于胞漿，棕色反應(yīng)物。正常對(duì)照組血管壁表達(dá)少;模型組表達(dá)明顯增多，與正常對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.01);與模型組比較，首烏延壽丹組及辛伐他汀組表達(dá)明顯減輕(P＜0.01)，2用藥組MMP-9表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是以血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，大量脂質(zhì)沉積，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖和遷移，細(xì)胞外基質(zhì)成分增多和泡沫細(xì)胞出現(xiàn)，最后粥樣斑塊形成為其主要病理基礎(chǔ)的疾病，其中VSMC增殖、遷移是其關(guān)鍵性環(huán)節(jié)之一[5]。已知血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF-B)是最有力的促有絲分裂源，可促進(jìn)動(dòng)脈中膜收縮型SMC轉(zhuǎn)化為分泌型SMC，并遷移到內(nèi)膜下參與粥樣斑塊形成[6]，同時(shí)分泌大量的活性物質(zhì)，促使細(xì)胞黏附及強(qiáng)烈的縮血管作用?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)能夠分解VSMC基底膜基質(zhì)，將SMC從基底膜中釋放出來(lái)，從而引起VSMC的移行，在AS發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起著十分重要的作用[7]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，AS的發(fā)生是以腎虛血瘀為其主要病理基礎(chǔ)的[8]。腎為元?dú)庵瑑?nèi)寓元陰元陽(yáng)，若年老之人腎氣虧虛，無(wú)力推動(dòng)血液運(yùn)行而致血流遲緩;或腎陽(yáng)虛衰，虛寒內(nèi)生，血液凝滯;或腎陰不足，虛火灼液，血液濃縮，最終瘀血阻滯脈道。這種腎虛而致血瘀的過(guò)程與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所論述的動(dòng)脈內(nèi)膜先有內(nèi)皮細(xì)胞損傷、凋亡，繼而脂質(zhì)沉積，纖維組織增生，以致AS斑塊形成的過(guò)程極為相似，因此認(rèn)為腎虛血瘀是AS形成的主要病理基礎(chǔ)。所以本文選擇補(bǔ)腎活血方首烏延壽丹作用于AS模型，觀察首烏延壽丹對(duì)AS血管PDGF-B、MMP-9表達(dá)的影響。

TC、TG和LDL-C是血漿中血脂的主要成分，HDL-C是AS的重要防御因子，有明顯抑制AS的發(fā)生發(fā)展和促進(jìn)其消退的作用。本實(shí)驗(yàn)研究表明，通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)12周后，所有高脂飼料喂養(yǎng)的日本大耳白兔血清TG、TC、LDL-C水平均較正常對(duì)照組升高，HDL-C水平降低，內(nèi)膜增厚，提示AS形成過(guò)程中存在血脂代謝紊亂，其中以模型組最為嚴(yán)重;與模型組比較，首烏延壽丹能夠顯著降低TG、TC、LDL-C水平，升高HDL-C水平，提示首烏延壽丹能夠通過(guò)改善血脂代謝紊亂并抑制AS形成。

PDGF是一種促細(xì)胞分裂劑，主要由血小板釋放。其中PDGF-B具有促進(jìn)動(dòng)脈中膜收縮型SMC轉(zhuǎn)化為合成型SMC，并向內(nèi)膜下遷移的作用[9]，增殖的SMC可吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞，從而加速AS的形成。

本實(shí)驗(yàn)中觀察到，模型組PDGF-B蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增多;與模型組比較，首烏延壽丹組PDGF-B蛋白表達(dá)明顯減輕，其效果與辛伐他汀相似，提示首烏延壽丹能降低PDGF-B蛋白水平，從而抑制SMC的增殖及轉(zhuǎn)型，進(jìn)而抑制AS的形成。

MMP是降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要酶類，可為SMC從中膜遷移至內(nèi)膜掃清道路[10]。其中MMP-9是MMP家族中的重要成員，主要功能是降解IV型膠原和彈力纖維，在基質(zhì)降解、VSMC遷移、AS形成以及促進(jìn)斑塊破裂上起重要作用[11]。本實(shí)驗(yàn)表明，模型組MMP-9蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增高;與模型組比較，首烏延壽丹組MMP-9蛋白表達(dá)明顯減輕，提示首烏延壽丹能降低MMP-9蛋白水平，從而抑制SMC從中膜向內(nèi)膜遷移。此結(jié)果與以往研究的系統(tǒng)給予MMP-9抑制劑[12]，早期可減少VSMC向內(nèi)膜遷移的結(jié)果相同。

綜上所述，首烏延壽丹能夠通過(guò)改善血脂代謝紊亂，抑制PDGF-B、MMP-9的表達(dá)、抑制內(nèi)膜增生而起到防治AS的作用。其效果與HMG-CoA還原酶抑制劑辛伐他汀相同，表明首烏延壽丹抗AS療效可靠。本文從分子生物學(xué)水平探討了首烏延壽丹抗AS機(jī)制，為臨床應(yīng)用首烏延壽丹防治AS提供了進(jìn)一步的理論依據(jù)。

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